组织工程化神经导管对外周神经修复的基础应用研究

发布时间：2017-08-19 13:24

  本文关键词：组织工程化神经导管对外周神经修复的基础应用研究

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【摘要】：外周神经缺损临床上较常见,全世界每年约一百万人发生周围神经损伤,该疾病严重影响患者的身心健康并造成其生活质量的下降。近百年来,神经缺损后的再生及最大限度的功能修复一直是国内外神经科学基础与临床应用研究的重点与亟待攻克的一大难题。自体神经移植术作为神经损伤修复的“金标准”,由于存在来源有限等局限性,严重制约了其在临床的广泛应用。近年来,随着组织工程学的发展和进步,为寻找理想的神经再生替代品开辟了新的方向。本研究利用静电纺丝技术制备胶原蛋白/PCL纳米纤维神经导管壳层,采用特制模具制备复合红景天苷微球的胶原蛋白多通道导管芯层,二者嵌套并1%京尼平交联,构建一种新型的管中管结构的神经导管支架材料。运用材料性能评价方法对导管支架材料的理化性能和力学性能进行分析。将大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与复合红景天苷微球的导管芯层材料复合培养不同时间。通过扫描电镜观察细胞与材料的黏附情况;CCK-8法检测细胞增殖能力;细胞免疫荧光化学法检测BMSCs向神经细胞分化过程中神经细胞标志分子表达的情况。复制Wistar大鼠坐骨神经15 mm缺损动物模型,大鼠随机分为5组,即空导管组,空白材料组,复合红景天苷微球材料组,自体神经组和神经缺损组,每组12只。术后一个月、两个月、三个月分别采集各组大鼠足迹并测量坐骨神经功能指数,采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析。术后五个月,重新暴露神经导管桥接处的坐骨神经,利用电生理仪检测再生神经的传导功能;标本取材后常规固定、切片,行组织学(HE)染色,S100,神经丝蛋白(Neurofilament,NF),神经胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)免疫组织化学染色,综合评价神经损伤修复和再生的效果。研究结果显示,红景天苷微球8 h时缓释率达最高水平,约为23%,8~72 h微球的缓释率略有降低且趋于平稳,其缓释率为(20±1)%,载荷红景天苷的微球具有良好的缓释效果。神经导管壳层交联前后的表面接触角分别为120°和0°,交联后壳层支架材料具有极强的亲水性;神经导管壳层交联前后的透气率分别为(60.2±3.4)%和(71.1±5.1)%,其差异不显著(P0.05);神经导管壳层交联前最大载荷为21.5~25.8 N,断裂载荷为12.3~15.7 N,交联后最大载荷为40.7~42.9 N,断裂载荷为28.2~33.1 N,交联前后差异显著(P0.05),壳层具有一定的力学强度。交联前后导管芯层的吸水率分别为(645±54)%和(764±88)%,两者比较差异显著(P0.05)。BMSCs在复合红景天苷微球的胶原蛋白芯层上具有良好的黏附、生长和增殖能力,鬼笔环肽免疫荧光化学染色显示可见神经样细胞形态。S100免疫荧光化学染色显示S100为阳性表达,复合红景天苷微球的芯层材料通过缓释红景天苷能诱导大鼠BMSCs向神经细胞分化。大鼠术后一个月,两个月,三个月大鼠足迹及坐骨神经功能指数显示,复合红景天苷微球导管组与自体神经组相近,显著高于其他组(P0.05)。电生理检测结果表明,复合红景天苷微球组与自体神经组的潜伏期无显著差别(P0.05),与其余各组大鼠潜伏期差异显著(P0.05)。HE染色结果显示,复合红景天苷微球材料组可见明显的再生轴突,空导管组再生轴突不明显。免疫组织化学染色结果显示,空导管组,空白材料组,复合红景天苷微球材料组,自体神经组S100、NF表达水平依次增强;相反,GFAP蛋白的表达依次减弱。复合红景天苷微球组修复效果明显优于空导管组,空白材料组,与自体神经组修复效果相近。本实验构建的复合红景天苷微球的胶原蛋白多通道神经导管具有良好的吸水性,透气性,组织相容性及一定的力学性能,能有效促进外周神经损伤的修复和功能重建,与自体神经移植效果相似,具有潜在的临床价值和应用前景。
【关键词】：胶原蛋白 红景天苷 骨髓间充质干细胞 外周神经损伤 组织工程 神经导管
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R745;R318.08
【目录】：

• 摘要2-4
• SUMMARY4-7
• 缩略词表7-12
• 第一章 文献综述12-21
• 1 外周神经缺损的现状12
• 2 神经修复的研究发展12-18
• 2.1 显微外科手术修复神经缺损12-13
• 2.2 神经移植术修复神经缺损13
• 2.2.1 自体神经移植术13
• 2.2.2 异体神经移植术13
• 2.3 组织工程学修复神经缺损13-18
• 2.3.1 生物材料支架14-15
• 2.3.2 种子细胞15-17
• 2.3.2.1 施旺细胞15-16
• 2.3.2.2 骨髓间充质干细胞16
• 2.3.2.3 脂肪干细胞16-17
• 2.3.2.4 神经干细胞17
• 2.3.2.5 胚胎干细胞17
• 2.3.3 辅助因子17-18
• 3. 神经导管的发展进程18-21
• 第二章 神经导管的构建与性能评价21-31
• 1 前言21-22
• 2 实验材料22
• 2.1 实验的主要试剂及主要溶液配制方法22
• 2.1.1 实验的主要试剂22
• 2.1.2 主要溶液配制方法（见附录二）22
• 2.2 主要仪器设备22
• 3 实验方法22-26
• 3.1 神经导管的构建22-24
• 3.1.1 红景天苷微球的制备22-23
• 3.1.2 神经导管壳层的制备23
• 3.1.3 导管芯层的制备23
• 3.1.4 合成神经导管并京尼平交联23-24
• 3.2 神经导管的性能评价24-25
• 3.2.1 红景天苷微球缓释的测定24-25
• 3.2.2 纳米纤维神经导管壳层表面接触角的测定25
• 3.2.3 纳米纤维神经导管壳层力学性能测试25
• 3.2.4 纳米纤维神经导管壳层透气性的检测25
• 3.2.5 导管芯层质量吸水率的测定25
• 3.3 统计分析25-26
• 4 实验结果26-29
• 4.1 扫描电镜材料的表观特征26-27
• 4.2 红景天苷微球的缓释效果27-28
• 4.3 纳米纤维神经导管壳层的表面接触角28
• 4.4 纳米纤维神经导管壳层的力学性能28-29
• 4.5 纳米纤维神经导管壳层的透气性29
• 4.6 导管芯层质量吸水率29
• 5 讨论29-31
• 第三章 材料与大鼠BMSCS相互作用的研究31-42
• 1 前言31
• 2 实验材料31-32
• 2.1 实验动物31
• 2.2 实验的主要试剂及主要溶液配制方法31-32
• 2.2.1 实验的主要试剂31-32
• 2.2.2 主要溶液配制方法（见附录二）32
• 2.3 主要仪器设备32
• 3 实验方法32-36
• 3.1 材料的制备32
• 3.2 BMSCs的提取、培养及鉴定32-33
• 3.3 BMSCs与材料的生物相容性33-36
• 3.3.1 细胞与材料的黏附性33
• 3.3.2 CCK-8 法测细胞在材料上的增殖33-34
• 3.3.3 细胞在材料上的生长及检测34-36
• 3.4 统计分析36
• 4 实验结果36-39
• 4.1 BMSCs的鉴定36-37
• 4.2 材料的表征及黏附性37-38
• 4.3 细胞在材料上的增殖38-39
• 4.4 神经相关标志分子的表达39
• 5 讨论39-42
• 第四章 复合红景天苷微球神经导管修复坐骨神经缺损的初步研究42-56
• 1 前言42-43
• 2 实验材料43-44
• 2.1 实验动物43
• 2.2 实验的主要试剂及主要溶液配制方法43
• 2.2.1 实验的主要试剂43
• 2.2.2 主要溶液配制方法（见附录二）43
• 2.3 主要仪器设备43-44
• 3 实验方法44-46
• 3.1 手术操作过程（见图 4-1）：44
• 3.2 大鼠足迹及坐骨神经功能指数的测定44-45
• 3.2.1 大鼠术后三个月采集大鼠的足迹44-45
• 3.2.2 大鼠坐骨神经功能指数（sciatic functional index，SFI）测定45
• 3.3 电生理检测45
• 3.4 组织学检查45-46
• 3.5 统计分析46
• 4 实验结果46-51
• 4.1 一般观察46-47
• 4.2 大鼠足迹及坐骨神经功能指数的测定47-48
• 4.3 电生理检测48-50
• 4.4 组织学检查50-51
• 5 讨论51-56
• 第五章 结论与展望56-58
• 1 结论56
• 2 不足与展望56-58
• 参考文献58-66
• 附录一66-67
• 附录二67-68
• 致谢68-69
• 作者简介69-70
• 导师简介70-72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 董茂盛;王佃亮;;生物支架材料——组织工程连载之二[J];中国生物工程杂志;2014年06期

2 赵汉宁,董晓先,董伟华,刘金保;黄芩甙诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究[J];现代中西医结合杂志;2005年05期

3 梁峰;马洁华;杨丽娜;;川芎嗪联合创伤性脑组织匀浆液诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年23期

4 宋玫,陈绍宗,韩骅,雄鹰;微囊化转NGF基因3T3细胞修复大鼠周围神经损伤的实验研究[J];中华整形外科杂志;2005年01期

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本文编号：700953