大鼠骨髓基质干细胞的培养及成骨成脂分化研究

发布时间：2017-08-20 16:36

  本文关键词：大鼠骨髓基质干细胞的培养及成骨成脂分化研究

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【摘要】：目的：骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）是最常用的骨组织工程种子细胞。具有很强的增值能力,在一定的诱导条件下能够分化为中胚层起源的组织,如骨、软骨和脂肪等。为修复重建由于创伤、感染、肿瘤等各种原因形成的组织缺损,提供了理想的治疗手段,是一项非常具有应用前景的技术。骨髓基质干细胞是骨组织工程的良好载体，以其为载体携带目的基因神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）和骨形态发生蛋白2（Bone morphogenetic protein,BMP2）移植进入骨折大鼠模型以促进骨折的愈合是课题《BMP2和NGF双基因转染骨髓基质干细胞移植治疗骨折的实验研究》（项目编号81160223)的主要研究内容。骨髓基质干细胞在骨髓中含量极低，仅占骨髓有核细胞总数0.001%-0.1%，体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的BMSCs，对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。建立一套简单易行有效的骨髓基质干细胞的培养、纯化、鉴定的方案，并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。以期进一步了解骨髓基质干细胞的生物学特性,为其应用于临床提供可靠的理论依据。 方法：将4周龄健康SD大鼠脱颈处死后，放入75%酒精浸泡约10分钟，无菌条件下取出股骨和胫骨，将股骨和胫骨表面肌肉及其他软组织剥离干净，PBS冲洗后，剪开两侧骨端，用1ml注射器吸取DMEM低糖培养液，从长骨一端插入注射器冲洗2次，将冲洗后的液体置于15ml无菌试管中，用3ml巴氏吸管适当吹打骨髓细胞。将此悬液置入70mm细胞培养皿内，加入适量完全培养基（DMEM-LG培养液+15%胎牛血清+1%青链霉素）。放置于37℃、5%CO2恒温培养箱内培养。通过贴壁培养法培养并将细胞进一步传代纯化，观察其生长特性。对细胞相关的性状进行观察及分析。绘制生长曲线，将生长状态良好的P7代细胞进行流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD45、CD90并作同型对照，取生长状态良好的P5代细胞分别向成骨、成脂方向诱导分化并分别进行茜素红及油红O染色，观察诱导结果。 结果：经该方法体外培养的SD大鼠BMSCs呈集落状贴壁生长，细胞形态主要为成纤维样细胞，显微镜下观察可见细胞成簇生长，类似漩涡状、鱼群状或菊花瓣状。P1-P5代BMSCs增殖速度快，细胞形态稳定,生长状态较好。其后逐渐减慢，P10代之后细胞形态明显老化，细胞边缘粗糙，包体变大，形状不规则。生长曲线显示骨髓基质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。用流式细胞仪进行细胞表型鉴定：BMSCs表达CD29和CD90，而不表达CD45，说明本实验培养的细胞符合大鼠BMSCs的表型特征。将以成骨诱导液诱导培养的BMSCs进行茜素红染色后可见明显的钙结节，而对照组未见钙结节。将以成脂诱导液诱导培养的BMSCs进行油红O染色后可见明显的脂滴，而对照组不明显。说明本实验培养的SD大鼠BMSCs具有成骨和成脂分化的能力。 结论：本实验采用的是一种相对简单易行的骨髓基质干细胞分离纯化的方法，可获得纯度高，活性好，，性状均一的骨髓基质干细胞。细胞生长旺盛，可连续稳定传代10代以上。该法操作简单，可大量分离、纯化、扩增骨髓基质干细胞，所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性，经诱导培养后具有多向分化潜能。可为组织工程提供充足的种子细胞来源，具有重要的现实意义。
【关键词】：骨髓基质干细胞 分离纯化 培养 分化 鉴定
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 英汉缩略词对照表11-12
• 前言12-14
• 1 材料与方法14-22
• 1.1 实验材料与仪器14-16
• 1.1.1 实验动物14
• 1.1.2 实验仪器14-15
• 1.1.3 主要实验试剂15
• 1.1.4 主要实验材料15-16
• 1.2 实验方法16-22
• 1.2.1 实验细胞取材16
• 1.2.2 大鼠 BMSCs 培养及传代16-17
• 1.2.3 大鼠 BMSCs 细胞形态观察17
• 1.2.4 大鼠 BMSCs 生长曲线绘制（MTT 法）17-18
• 1.2.5 大鼠 BMSCs 流式细胞仪细胞表型鉴定18
• 1.2.6 大鼠 BMSCs 成骨诱导18-20
• 1.2.6.1 成骨诱导试剂18-19
• 1.2.6.2 成骨诱导步骤19-20
• 1.2.7 大鼠 BMSCs 成脂诱导20-22
• 1.2.7.1 成脂诱导试剂20
• 1.2.7.2 成脂诱导步骤20-22
• 1.2.8 大鼠 BMSCs 的冻存22
• 2 结果22-28
• 2.1 大鼠 BMSCs 生长及形态观察22-24
• 2.2 MTT 法绘制大鼠 BMSCs 生长曲线24-25
• 2.3 大鼠 BMSCs 流式细胞仪细胞 CD29、CD45、CD90 表型鉴定结果25-26
• 2.4 大鼠 BMSCs 成骨诱导结果26-27
• 2.5 大鼠 BMSCs 成脂诱导结果27-28
• 3 讨论28-37
• 3.1 BMSCs 的发现28-29
• 3.2 BMSCs 的定义29
• 3.3 BMSCs 的体外分离与培养29-32
• 3.4 BMSCs 的鉴定32-35
• 3.4.1 BMSCs 的表型鉴定32-33
• 3.4.2 BMSCs 的多向分化潜能鉴定33-35
• 3.5 BMSCs 培养经验总结35-37
• 4 结论37-38
• 参考文献38-44
• 综述44-56
• 参考文献51-56
• 攻读硕士学位期间科研成果目录56-57
• 致谢57

本文编号：707741