纳米氧化锆骨组织工程支架干细胞附着成骨研究

发布时间：2017-08-20 21:02

  本文关键词：纳米氧化锆骨组织工程支架干细胞附着成骨研究

  更多相关文章： 纳米氧化锆 多孔支架 骨髓间充质干细胞 骨组织工程

【摘要】：研究背景： 外伤、感染、先天畸形、肿瘤外科手术等引起的颌面部骨组织缺损是口腔颌面部常见疾病,不仅会造成患者咀嚼、吞咽、语言等口腔功能障碍,还因严重的颜面部畸形,对患者精神、心理产生极大的危害。据报道,颌面部大面积骨组织缺损患者中,有90%者会产生自杀倾向。可见完善的口腔颌面部骨组织缺损治疗对患者身心具有重要意义。 骨移植术是治疗骨缺损的传统手段,其中自体骨移植一直被认为是治疗骨缺损的“金标准”,具有较高的治愈率。然而,自体骨移植存在骨来源量有限以及造成供骨区二次损害的缺陷。异体骨移植方法尽管避免了对患者供区部位的损害,但又带来了感染率高及免疫排斥反应的危险。骨组织工程运用工程学和生命科学的基本原理与技术,在体外模拟人骨构建三维多孔支架材料并诱导种子细胞在支架上生长、成骨,在解决口腔颌面部骨组织缺损中显示出很好的发展前景。 骨组织工程原理包括支架材料、种子细胞和成骨因子三个方面。理想的支架材料应具有良好的生物相容性、可塑性,足够的机械强度,应满足一定的孔隙结构。良好的生物相容性是保证支架材料能够作为细胞生长载体及植入机体内应用的前提,材料本身及其降解产物必须对机体安全,不引起任何炎症和毒性反应。良好的可塑性是指材料能够按照骨缺损形状、大小成型。足够的机械强度保证了骨缺损修复前支架能够起到支撑作用,维持骨的生理运动。 目前,用于骨组织工程的支架材料主要分为两大类,即生物衍生材料和人工合成材料。前者主要有天然骨、珊瑚骨、天然高分子聚合物(胶原、纤维蛋白)等。此类材料由于具有与天然骨相似的骨架结构、利于成骨细胞粘附生长,具有一定的骨传导作用。但是,天然骨存在免疫原性问题,珊瑚骨不易加工成型,天然高分子聚合物降解速度难以控制,并且他们均具有机械强度不足的缺陷。 人工合成材料致力于模拟天然骨形成机制,制备出仿生径向梯度分布、具生物活性且多孔的细胞支架材料,成为组织工程骨材料的研究热点。目前,人工合成材料大体上分为有机高分子材料、无机生物陶瓷材料以及多种复合材料。各种材料虽然各有优点,但是也因各自固有的缺点而未能广泛应用。聚酯类有机材料容易塑形,可降解性好,然而其降解产物呈酸性,对体内微环境有影响,限制了实际的应用。因良好的生物相容性和骨传导性而成为目前应用较多的骨替代品羟基磷灰石、磷酸三钙等无机生物陶瓷类材料,也存在脆性较大、柔韧性不够、不易加工成型的缺点。人们迫切寻求一种机械性能更加优越的生物支架材料。 氧化锆陶瓷材料的化学性能稳定,机械强度优越,自上世纪60年代开始被用作生物材料。其压缩强度及三点弯曲强度可分别达到2000和900MPa。长期的研究表明,氧化锆陶瓷对细胞、肌肉、口腔粘膜及骨组织没有任何毒性作用,并且与已广泛应用的骨折固定材料钛金属相比,其生物相容性更好,表面细菌粘附及增殖率更低。作为表面涂层能够明显地增强钛合金(Ti-6A1-4V)的表面活性,增强牙科种植体的骨结合作用。氧化锆陶瓷良好的生物相容性不断得到医学界认可,被广泛应用于牙科全瓷修复、人体硬组织替代材料,以及其他生物材料的增韧成分。将氧化锆陶瓷引入骨组织工程,构造三维联通多孔支架,在机械性能上表现出明显的优势。 1970年,Friedenstein等研究发现骨髓中存在一种具有很高的增殖与分化潜能,并有成骨能力的成纤维细胞样集落形成单位(CFU-F)。紧接着研究发现CFU-F还具有向多种骨髓组织细胞分化的潜能,于是学者们提出了间充质干细胞(BMSCs)的概念。 在特定条件下,骨髓间充质干细胞能够向成骨、成软骨、成纤维、成脂肪、成肌细胞及神经细胞等方向分化。其中,在添加地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸的条件培养基中,骨髓间充质干细胞可向成骨细胞样细胞分化,并表现出成骨特性。有学者比较诱导剂添加量对其成骨性的影响发现,地塞米松10"8mol/L,β-甘油磷酸钠1Ommol/L,抗坏血酸50μmol/L条件下,人骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的效率较高。骨髓间质干细胞可通过抽取少量骨髓培养获得,获取方式容易,并可多次抽取,体外培养可多次传代,确保足够的细胞量。目前运用骨髓间质干细胞复合支架材料研究最为广泛。 因而,我们希望结合纳米氧化锆优越的机械性能和良好的生物相容性,构建三维联通多孔骨组织工程支架,探索该支架的成型方法及其理化性能,在体外接种犬骨髓间充质干细胞,评价其作为细胞载体,供干细胞附着、生长及成骨情况,进而评价其构建组织工程骨的可行性。 目的： 探索不同孔隙率纳米氧化锆多孔骨组织工程支架的成型方法及其理化性能,建立体外分离、培养和鉴定犬骨髓间充质干细胞的方法体系,接种犬骨髓间充质干细胞于纳米氧化锆多孔支架,并植入beagle犬体内,评价该支架作为细胞载体,供干细胞附着、生长及成骨情况,进而评价其构建组织工程骨的可行性。 方法： 1.不同孔隙率纳米氧化锆多孔陶瓷支架的成型及性能研究 60ppi聚氨酯为成型模板,纳米级氧化锆粉体为初始原料,运用模板复制法,经1、3、5、7次循环浸渍次数成型不同孔隙率纳米氧化锆多孔坯体,高温烧结后成型多孔支架。SEM及显微CT测定其孔隙率,万能试验机测试其压缩强度,探索成型循环次数与所得支架孔隙结构及机械强度的关系。溶血实验评价研究制备的纳米氧化锆多孔支架的生物安全性。 2.建立犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养和鉴定的方法体系 全麻下抽取犬髂前上棘全骨髓,全骨髓贴壁分离法分离骨髓间充质干细胞(BMSCs),置于37℃C、5%C02、饱和湿度培养箱中培养、传代扩增。倒置显微镜每日观察细胞生长形态；计数法测定细胞生长增殖曲线；取生长状态良好的第三代细胞,添加成骨诱导液诱导培养,倒置显微镜观察细胞形态变化；碱性磷酸酶染色与茜素红染色以鉴定其成骨细胞向分化能力。 3.犬骨髓间充质干细胞附着纳米氧化锆骨组织工程支架生长及成骨研究 支架经表面处理后接种犬骨髓间充质干细胞,添加成骨诱导培养基进行体外培养,SEM观察细胞在支架上早期附着情况,MTT法测定支架上细胞第1、3、6、9、12天增殖情况,PNPP偶氮法测定支架上细胞第1、3、5、7、14天的碱性磷酸酶(ALP)表达水平,初步评价其构建组织工程骨的可行性。另外,通过比较不同孔隙率支架上BMSCs附着、生长及成骨分化情况,结合支架压缩强度以期筛选出既利于细胞生长又具高强度的纳米氧化锆骨组织工程支架。最后,通过建立犬下颌骨缺损模型,将筛选出的支架接种犬骨髓间充质干细胞植入犬下颌骨缺损处,观察其体内成骨情况。 结果： 1.不同孔隙率纳米氧化锆多孔支架性能研究。不同孔隙结构的聚氨酯模板能够获得不同孔径及孔隙率的纳米氧化锆多孔支架。60ppi聚氨酯模板经多次成型循环能够获得不同孔隙率支架,并且随循环次数增多,孔隙率逐渐降低,经1、3、5、7次成型循环后其孔隙率分别为92.667%、85.913%、75.228%、67.983%；随着孔隙率的降低,其压缩强度逐渐增高,其结果依次为0.62MPa、0.83MPa、2.62MPa、4.38MPa。研究制备的纳米氧化锆多孔支架的溶血率为2.19%,小于5%,按照《中华人民共和国医药行业标准YY/T0127.1-9》标准,符合生物材料安全标准,可用于生物实验。 2.犬骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定。原代细胞培养48h后首次换液可见少量细胞贴壁,呈梭形、三角形,血细胞及单核细胞因不能贴壁或贴壁能力不同,经多次换液、传代而逐渐去除。随着培养时间的延长,细胞形态逐渐趋于一致,螺旋状生长,形成多个克隆单位,7-10天进行首次传代。传代后细胞增殖活跃,平均3-4天可长满瓶壁的90%。第三代细胞添加诱导剂后,细胞形态向多边形转换,培养10天,细胞行碱性磷酸酶染色呈阳性；21天茜素红染色法染色钙结节呈阳性。 3.不同孔隙率纳米氧化锆多孔支架上细胞生长及分化情况。其1、3、6、9、12天内细胞增殖测试OD值分别为0.261,0.604,1.215,1.385,1.506；1、3、5、7、14天内ALP表达水平测试OD值分别为0.016、0.020、0.023、0.032、0.062,与空白对照组支架检测值差异均有统计学意义(P0.05)。比较不同孔隙率(92.667%、85.913%、75.228%、67.983%)支架对细胞附着生长的影响可见,孔隙率为75.228%支架组具有最高的细胞接种率及早期ALP水平,孔隙率为92.667%的支架细胞接种率最低。四组支架的细胞接种率依次为40.7%、58.14%、76.74%和61.63%。在后期的培养过程中,高孔隙率组支架(92.667%组)表现出更高的细胞增殖率及晚期ALP表达水平(P0.05)。体内实验表明,接种有骨髓间充质干细胞的纳米氧化锆多孔支架表现出良好的成骨作用,支架与骨组织之间形成紧密的结合。 结论： 1.模板复制法成型的纳米氧化锆支架具有三维联通的多孔结构,可以满足细胞生长繁殖、代谢产物排泄、血液与组织液流通的需要。 2.研究制备的纳米氧化锆多孔支架符合生物材料的安全性标准,支架孔隙、外形精确可控,机械强度优越,满足体内试验的强度要求。 3.研究制备的纳米氧化锆多孔支架具有作为组织工程支架联合干细胞构建组织工程骨的可行性。犬骨髓间充质干细胞能够在研究制备的纳米氧化锆多孔支架表面及内部附着、生长并表达早期的成骨标志,植入体内后,表现出良好的骨缺损修复作用。
【关键词】：纳米氧化锆 多孔支架 骨髓间充质干细胞 骨组织工程
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R783.1
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-18
• 第一章 不同孔隙率纳米氧化锆骨组织工程支架制备及性能研究18-26
• 1. 研究目的18
• 2. 材料和方法18-19
• 3. 结果19-23
• 4. 讨论23-25
• 5. 结论25-26
• 第二章 犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养及成骨鉴定26-34
• 1. 研究目的26
• 2. 材料和方法26-29
• 3. 结果29-31
• 4. 讨论31-33
• 5. 结论33-34
• 第三章 纳米氧化锆骨组织工程支架干细胞附着成骨研究34-45
• 1. 研究目的34
• 2. 材料和方法34-37
• 3. 结果37-42
• 4. 讨论42-44
• 5. 结论44-45
• 全文总结45-46
• 参考文献46-49
• 文献综述49-57
• 参考文献53-57
• 攻读硕士期间发表的论文57-59
• 致谢59-61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 吴林波,丁建东;组织工程三维多孔支架的制备方法和技术进展[J];功能高分子学报;2003年01期

2 赵东海;杨淑艳;齐玲;杨宁江;;骨髓间充质干细胞分离方法的实验研究[J];吉林医药学院学报;2010年04期

3 王运涛;吴小涛;郑启新;陈辉;李永刚;茅祖斌;;转化生长因子β_1/Smad3促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究[J];医学研究生学报;2007年07期

4 谢安;汪泱;;胚胎干细胞研究进展[J];江西医学检验;2006年02期

5 崔红强;吴绍华;;骨髓间充质干细胞研究进展[J];西南军医;2009年04期

6 王阳;金磊;史小蕾;孟祥康;;三维连通多孔氧化锆骨组织工程支架制备研究[J];医学研究生学报;2012年06期

7 安江峰;闫玉华;;多孔高分子复合材料的制备技术[J];生物骨科材料与临床研究;2005年06期

8 杨维东;口腔颌面骨替代材料与骨组织工程[J];实用口腔医学杂志;1999年06期

9 李鲁生;张涵;王成俊;程洪斌;安沂华;;骨髓间充质干细胞的分离方法和生物学特性[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年10期

10 李忠,杨柳;骨组织工程学间充质干细胞研究进展[J];中华创伤杂志;2003年12期

，

本文编号：708835