直接快速液氮冻存人羊膜的初步研究

发布时间：2017-09-06 20:50

本文关键词：直接快速液氮冻存人羊膜的初步研究

【摘要】：目的探索快速液氮冷冻保存人羊膜保存方法的抗冻剂配方,并与其他常用保存方法比较,为建立深低温保存高活性的人羊膜库提供依据。本研究分为两部分：实验一、快速液氮保存人羊膜抗冻剂的初步筛选实验二、液氮保存法与其他保存方法的比较研究方法实验一、选取12只健康剖宫产妇胎盘,剥离其羊膜,根据预处理抗冻剂的不同将羊膜随机分6组保存：A组(DMEM对照组)、B组(DMEM/甘油组)、C组(DMEM/DMSO组)、D组(DMEM/海藻糖组)E组(DMEM/甘油/DMSO/组)、F组(DMEM/甘油/DMSO/每藻糖组)。A组经不含抗冻剂的DMEM处理后,直接将其快速放入液氮中冻存,简称快冻△。其余5组分别经不同抗冻剂预处理后快冻。保存第1、3、6个月后,取羊膜行HE染色观察羊膜细胞形态变化,台盼蓝染色计算羊膜上皮细胞死亡率,免疫组织化学法检测细胞因子(EFG)表达,各组实验结果分别对照组(A组)及新鲜羊膜(G组)对比,以筛选出快冻保存羊膜的最优抗冻剂配方。实验二、选取12只健康剖宫产妇胎盘,剥离其羊膜,根据保存方法的不同将羊膜随机分4组：A组(液氮保存组)、B组(甘油4℃保存组)、C组(DMEM/甘油-80℃保存组)、D组(冷冻干燥保存组)A组采用实验一筛选出的抗冻剂配方处理后放入液氮中快冻。其余3组按各自保存方法处理。保存后第1、3、6个月取羊膜行HE染色、台盼蓝染色、免疫组织化学法检测羊膜活性,各组观察结果分别新鲜羊膜(E组)对比。结果实验一、①新鲜羊膜由单层立方上皮、基底膜和无血管基质组成。各组保存羊膜结构均遭到不同程度破坏。其中,F组羊膜上皮组织改变最小,保存6个月后羊膜细胞形态完整,与新鲜羊膜接近；A组羊膜结构破坏最明显,保存6个月后上皮细胞大部分破裂、基底膜溶解消失,羊膜连续性与完整性均遭到破坏；其余各组保存1个月后羊膜结构尚可,3个月后羊膜细胞形态改变加剧,6个月后羊膜分别出现细胞排列松散、脱失、胞核固缩、细胞空泡样变等。 ②各组羊膜细胞死亡率随保存时间的延长而呈递增趋势。F组细胞存活情况最好,保存6个月后羊膜细胞死亡率仍低于20%；A组保存效果最差,3个月细胞已半数死亡(59.75±11.12%),6个月后羊膜细胞大部分死亡(81.50±4.50%)；B组保存效果也不理想,在各时间点的细胞死亡率均超过20%；C、D、E3组保存1个月后细胞存活良好,但3个月的保存效果欠佳(死亡率20%)。 ③羊膜EGF主要分布于上皮层,各组保存1、3、6个月EGF表达与新鲜羊膜(G组)相比,A、B、C、D、E5组差异有统计学意义(P0.05),F组与新鲜羊膜无明显差别(P0.05)。实验二、①A组保存羊膜上皮细胞形态完整紧凑,与新鲜羊膜差别不大；B组保存1个月羊膜结构完整,但3个月后部分细胞出现破裂、脱失,基底层变薄,6个月后多数细胞破裂、呈绒毛样外观；C组保存1、3个月可见羊膜细胞排列整齐,基底膜完整而连续,6个月后上皮细胞结构改变,少部分细胞溶解；D组保存羊膜细胞结构变化不明显,6个月可见部分细胞胞核固缩、上移、空泡样变,羊膜各层结构较清晰。 ②A组保存效果较好,1、3、6月羊膜细胞死亡率均低于20%；C组保存羊膜细胞较差,在各时间点的细胞死亡率均超过20%；B组和D组保存1个月后羊膜细胞已全部死亡。 ③与新鲜羊膜(E组)EGF表达相比,A组保存1、3、6个月均无明显差别(P0.05),B、C2组各时间点均有显著差别(P0.05),D组保存1个月无统计学差异(P0.05),3、6个月差异有统计学意义(P0.05)。结论： 1、对于直接快速液氮冻存人羊膜,DMEM/甘油/DMSO/海藻糖复合抗冻剂的效果最好,羊膜可维持较高的活性； 2、与其他保存方法相比,直接快速液氮冻存法在维持羊膜细胞的存活和细胞因子的表达方面均有一定的优势。 3、此法操作简单,无需程序降温仪等特殊设备,适合于各级医院大批量人羊膜的储存。
【关键词】：人羊膜 抗冻剂 液氮 深低温保存 快冻
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.52
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