钴离子对人肾小管上皮细胞毒性及Bax、Bcl-2基因表达变化的体外实验研究

发布时间：2017-09-13 05:17

  本文关键词：钴离子对人肾小管上皮细胞毒性及Bax、Bcl-2基因表达变化的体外实验研究

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【摘要】：背景:由于优良的机械性能、耐磨损、制作简单、价格合理等优点,钴基合金成为牙体牙列缺损、牙列缺失、颌骨缺损等疾病的常规修复材料。研究显示,长期接触物理、化学以及生物环境,铸造合金在口内容易发生电化学腐蚀,析出金属离子。电化学腐蚀析出的金属离子会接触邻近的细胞和组织,并通过血液循环分布到全身各处,患者易出现牙龈染色、牙龈炎、牙周炎、过敏等不良反应。钴基合金腐蚀析出的离子以Co2+为主,Co2+是否对人体全身健康系统造成损害,国内外目前均未见明显报道。体内的Co2+绝大部分经肾脏排泄,经肾小球滤过后在肾小管被重吸收,因此Co2+更容易蓄积在肾小管上皮细胞。本研究以人肾小管上皮细胞为研究对象,采用MTT法和RT-PCR法联合评价Co2+的肾细胞毒性,以期为临床上钴基合金修复体的选择提供实验依据。目的:1.研究钴离子对人肾小管上皮细胞的细胞毒性。2.探讨钴离子对人肾小管上皮细胞凋亡基因Bax、Bcl-2表达变化的影响;3.评价钴离子的生物安全性,初步探讨钴离子影响人肾小管上皮细胞生长的机制。方法:1.体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2),以5种浓度(0μM、2.5μM、5.0μM、7.5μM、10μM)的Co2+培养液分别干预培养细胞12h、24h、48h。2.使用倒置显微镜观察各时间点、各浓度培养组细胞的生长状态,记录细胞的形态变化。3.采用MTT比色法检测各时间点、各浓度培养组细胞的吸光度值,测定细胞的相对增殖率。4.应用RT-PCR法检测各时间点、各浓度组细胞凋亡基因Bax以及Bcl-2mRNA的表达情况,探讨Co2+对肾小管上皮细胞凋亡的影响。5.采用SPSS17.0统计软件对所得的实验数据进行单因素方差分析。结果:1.倒置显微镜观察细胞形态:肾小管上皮细胞正常为卵圆或短梭形,似铺路石样排列较紧密,贴壁生长好。随着Co2+作用浓度和时间的增加,细胞间隙增大、数量减少、部分细胞形态呈长梭形;高浓度干预24h以上时,细胞所剩无几、异型性生长、无完整细胞形态、悬浮细胞多、凋亡率高。2.MTT法检测结果显示:与阴性对照组相比较,各实验组的OD值表达差异显著(P0.05)。随着Co2+作用浓度、时间地增加,细胞的吸光度值逐渐减小,细胞的增殖率逐渐下降。3.RT-PCR法检测结果显示:(1)相同作用时间时:各组Bax mRNA的表达增高,差异显著(P0.05)。Bcl-2 mRNA的表达降低,差异显著(P0.05)。(2)相同作用浓度时:各组Bax mRNA表达增高,差异不显著(P0.05)。Bcl-2 mRNA的表达降低,差异显著(P0.05)。随着Co2+作用浓度以及时间地逐渐增加,Bax mRNA的表达量上升,Bcl-2 mRNA的表达量下调,两者的比值Bax/Bcl-2逐渐增大,促进了细胞凋亡地发生。结论:1.低浓度(7.5μM)钴离子在观察时间内(12h-48h)对人肾小管上皮细胞不存在毒性作用,高浓度(≥7.5μM)干预24h后对细胞有轻度毒性。2.随着Co2+作用浓度、时间地不断增加,Co2+促进了人肾小管上皮细胞中凋亡基因Bax mRNA的表达,抑制了Bcl-2 mRNA的表达,使肾小管上皮细胞发生凋亡。3.Co2+对人肾小管上皮细胞的生长、增殖和凋亡存在一定影响,与作用浓度、时间呈正相关,但其生物安全性还需进一步的临床观察和实验验证。
【关键词】：钴离子 人肾小管上皮细胞 细胞毒性 细胞凋亡
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R783.1
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料和方法13-21
• 2.1 主要实验材料13-15
• 2.1.1 实验细胞来源13
• 2.1.2 主要试剂及来源13
• 2.1.3 主要仪器设备13-14
• 2.1.4 主要液体的配制14-15
• 2.2 主要实验方法15-20
• 2.2.1 细胞培养15-16
• 2.2.2 实验分组16
• 2.2.3 钴离子干预培养HK-2 细胞16
• 2.2.4 MTT比色法检测细胞的相对增殖率16-17
• 2.2.5 RT-PCR法检测细胞凋亡基因Bax、Bcl-2 的表达变化17-20
• 2.3 统计学分析20-21
• 第3章 实验结果21-28
• 3.1 HK-2 细胞的形态学观察21-23
• 3.1.1 钴离子干预培养 12h的细胞形态21
• 3.1.2 钴离子干预培养 24h的细胞形态21-22
• 3.1.3 钴离子干预培养 48h的细胞形态22-23
• 3.2 MTT法检测HK-2 细胞细胞增殖率结果23-24
• 3.3 RT-PCR检测Bax、Bcl-2 基因的表达结果24-28
• 3.3.1 RT-PCR法检测 12h、24h和 48h各组细胞Bax mRNA表达情况.1424-25
• 3.3.2 RT-PCR法检测 12h、24h和 48h各组细胞Bcl-2 mRNA表达情况25-27
• 3.3.3 Image J软件测定各时间点各浓度组Bax、Bcl-2 基因的相对灰度值27-28
• 第4章 讨论28-33
• 第5章 结论与展望33-34
• 5.1 结论33
• 5.2 展望33-34
• 致谢34-35
• 参考文献35-38
• 附图38-43
• 攻读硕士学位期间的研究成果43-44
• 综述44-50
• 参考文献48-50

【参考文献】

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本文编号：841739