成骨化羊ADSCs复合表面改性融合器构建组织工程化骨的研究

发布时间：2017-09-20 06:37

  本文关键词：成骨化羊ADSCs复合表面改性融合器构建组织工程化骨的研究

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【摘要】：目的:当今脊椎退行性疾病的发病率不断上升。其治疗方法主要包括脊柱融合和非融合技术。本研究在相关文献报道基础上,利用纳米化β-磷酸三钙/壳聚糖/聚己内酯(β-TCP/CS/PCL)仿生椎间融合器和钛金属椎间融合器支架复合成骨化羊ADSCs来构建组织工程化骨,测定其成骨潜能及细胞生物相容性,以验证体外构建组织工程骨的可行性,为今后临床应用建立理论及实验基础。方法:1.羊脂肪基质细胞的分离培养:取无菌山羊腹部脂肪组织,0.1%I型胶原酶消化后以完全培养基原代培养,传至第3代。冻存备用。2.ADSCs成骨方向诱导及分组:取第3代ADSCs,实验组以含成骨诱导剂的完全培养液培养,对照组仅用完全培养液培养。诱导14天后行碱性磷酸酶(ALP)染色,钙结节茜素红染色,及骨钙素表达以检测成骨活性。3.纳米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器和钛金属融合器的制备及表面改性:纳米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器分为两组,A组使用RGD多肽修饰,B组为未修饰组;钛金属融合器分为两组,C组使用飞秒激光行表面纳米级沟槽改性,D组为表面未改性组。4.成骨诱导后的细胞接种于上述融合器复合培养,分别于培养后的第1、7、14、21天行扫描电镜观察,第1、4、7、10、13、16、19、22天行MTT细胞增殖及ALP定量检测。结果:1.原代培养24h后,ADSCs已沉降贴壁,形态不规则,多为圆型或多角型。72h后ADSCs已逐渐伸展为梭形,体积增大,部分细胞有粗大突起。培养3代后,细胞形态规则,呈长梭状,增生活跃。ADSCs成骨诱导后形态发生改变,由梭形变为多角形。成骨化鉴定ALP染色可见多数细胞核、胞质内染色呈阳性。茜素红染色可见细胞之间有团块状的钙盐沉积,呈深红色或橘红色结节,多个矿化结节可融合。实验组较对照组骨钙素有明显升高,差异有显著性意义。2.四组融合器复合培养后扫描电镜显示,A、B组内有大量细胞粘附,排列良好,完全伸展,A组相比B组细胞生长旺盛。C组表面细胞粘附数量少,D组较C组细胞脱落更为明显。A、B组较C组细胞增殖活跃。3.A、B、C组前14天MTT结果及ALP酶活性均随培养时间延续而递增,后期细胞增殖速率缓慢。A、B两组每个时间点OD值ALP酶活性均明显高于C、D组,差异有显著性意义(P0.05)。A组每个时间点OD值及ALP酶活性均明显高于B组,差异有显著性意义(P0.05)。C组每个时间点OD值及ALP酶活性均高于与D组,差异有显著性意义(P0.05)。结论:1.利用胶原酶消化、贴壁分离羊ADSCs,成骨诱导后经检测证实其成骨潜能。羊ADSCs可用于构建脊柱组织工程的种子细胞。2.成骨化ADSCs与纳米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器复合培养后,细胞在支架内部生长良好,且分泌大量细胞外基质,表明体外成功构建了组织工程化骨,该构建的复合物有应用于临床作为椎间融合器的可行性。RGD有利于种子细胞的粘附,促进细胞增殖。3.成骨化ADSCs与钛合金椎间融合器复合培养后,细胞仅在在物理改性材料表面生长,且细胞外基质分泌不明显,非表面改性组细胞脱落较多,表明飞秒激光表面改性的纳米级沟槽结构有利于种子细胞的粘附、生长。4.接受RGD化学修饰的生物可降解性融合器存在多孔性及合适的细胞生长环境,而钛合金融合器接种激光物理修饰细胞仅能停留于表面,无法往材料内部纵深生长,生物可降解性融合器较金属融合器具有显著的生物学优势及应用潜能。
【关键词】：β-磷酸三钙/壳聚糖/聚己内酯 钛合金 融合器 脂肪基质细胞 RGD 激光 表面改性 组织工程化骨
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08;R68
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、羊脂肪基质细胞的分离培养及体外成骨诱导15-25
• 1.1 材料与方法15-18
• 1.1.1 试验材料15-16
• 1.1.1.1 动物来源15
• 1.1.1.2 主要仪器设备15
• 1.1.1.3 主要实验材料15-16
• 1.1.1.4 主要试剂及配制方法16
• 1.1.2 羊ADSCs的分离、培养、鉴定及体外成骨细胞定向诱导分化16-17
• 1.1.2.1 羊腹部脂肪组织的提取16
• 1.1.2.2 ADSCs的纯化及原代培养16-17
• 1.1.2.3 ADSCs的传代培养及冻存17
• 1.1.2.4 多聚赖氨酸防脱片的制备17
• 1.1.2.5 ADSCs体外向成骨细胞诱导分化17
• 1.1.3 成骨化羊ADSCs的鉴定17-18
• 1.1.3.1 碱性磷酸酶(ALP)染色17-18
• 1.1.3.2 茜素红钙结节染色18
• 1.1.3.3 骨钙素检测18
• 1.1.4 统计学方法18
• 1.2 结果18-22
• 1.2.1 脂肪基质细胞的原代及传代培养的形态学观察18-19
• 1.2.2 脂肪基质细胞成骨诱导后的形态学观察19-20
• 1.2.3 成骨化羊ADSCs的碱性磷酸酶（ALP）染色鉴定20-21
• 1.2.4 成骨化羊ADSCs的茜素红钙结节染色鉴定21
• 1.2.5 骨钙素检测结果21-22
• 1.3 讨论22-24
• 1.3.1 种子细胞的选择22
• 1.3.2 种子细胞向成骨化诱导22-23
• 1.3.3 成骨诱导后的鉴定23-24
• 1.4 小结24-25
• 二、成骨化羊ADSCs与纳米化β-TCP/CS/PCL及钛金属融合器复合培养及检测25-42
• 2.1 材料与方法25-28
• 2.1.1 主要仪器设备和实验材料25-26
• 2.1.1.1 主要仪器设备25
• 2.1.1.2 主要实验材料25-26
• 2.1.2 纳米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器的制备26
• 2.1.2.1 仿生融合器尺寸的确定26
• 2.1.2.2 仿生融合器的制备及消毒处理26
• 2.1.3 纳米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器性能检测26
• 2.1.3.1 孔隙率测定26
• 2.1.3.2 力学性能检测26
• 2.1.3.3 孔径测定26
• 2.1.4 钛合金融合器的制备及飞秒激光表面改性26-27
• 2.1.5 β-TCP/CS/PCL融合器的RGD修饰及成骨化ADSCs的接种27
• 2.1.6 钛合金融合器复合成骨化ADSCs培养27-28
• 2.1.7 四组融合器复合细胞培养后扫描电镜(SEM)观察28
• 2.1.8 MTT检测细胞增殖活性及碱性磷酸酶活性定量检测28
• 2.2 结果28-36
• 2.2.1 纳米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器的大体形貌和微观形貌28-29
• 2.2.2 纳米化β-TCP/CS/PCL仿生融合器的理化性征检测29-31
• 2.2.3 激光改性前后钛合金融合器的大体形貌和微观形貌31
• 2.2.4 四组融合器复合细胞培养后扫描电镜(SEM)观察31-33
• 2.2.5 MTT检测细胞增殖活性结果33-35
• 2.2.6 碱性磷酸酶活性定量检测35-36
• 2.3 讨论36-40
• 2.3.1 飞秒激光技术的应用36-37
• 2.3.2 RGD多肽的应用37
• 2.3.3 支架材料的选择和制备37-38
• 2.3.4 细胞活性的检测38-39
• 2.3.5 种植体材料的复合39
• 2.3.6 组织工程支架的评价指标39-40
• 2.4 小结40-42
• 结论42-43
• 参考文献43-49
• 发表论文和参加科研情况说明49-50
• 综述50-62
• 综述参考文献57-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张利,李玉宝,杨爱萍,左奕,吕国玉,魏杰;骨组织工程用纳米羟基磷灰石/壳聚糖多孔支架材料的制备及性能表征[J];功能材料;2005年02期

2 郭洪刚;马信龙;;骨代谢相关基因单核甘酸多态性在脊柱后纵韧带骨化发生中的作用[J];中国脊柱脊髓杂志;2011年10期

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本文编号：886477