小鼠成体干细胞体外诱导成肝能力比较及与丝素蛋白纤维相容性的实验研究

发布时间：2017-10-06 20:15

  本文关键词：小鼠成体干细胞体外诱导成肝能力比较及与丝素蛋白纤维相容性的实验研究

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【摘要】：目的1.分离、培养小鼠脂肪及骨髓间充质干细胞,比较两种成体干细胞体外增殖能力、多向分化潜能及向肝脏样细胞诱导分化的能力；2.比较两种成体干细胞与丝素蛋白纤维在体外和体内的相容性,以及在丝素蛋白纤维上诱导成肝能力；3.比较两种成体干细胞及两种成体干细胞复合丝素蛋白纤维移植改善急性肝损伤小鼠肝功能的效果。方法1.采用胶原酶I消化离心法分离、培养小鼠脂肪间充质干细胞；采用骨片法分离、培养小鼠骨髓间充质细胞；通过细胞形态学比较两种成体干细胞的形态差异,CCK8测定细胞生长曲线、流式细胞技术检测细胞表面标志物,成脂、成骨诱导分化能力分析比较两种细胞的体外增殖能力及多向分化潜能；采用成肝诱导培养基将两种成体干细胞向肝脏样方向诱导,在诱导第10天,收集细胞,通过RT-PCR, Western-Blot技术、细胞免疫荧光技术对两种成体干细胞向肝脏样细胞诱导分化的能力进行鉴定、比较。2.体外采实验部分HE染色、扫描电镜技术和激光共聚焦显微镜细胞活体3D成像技术检测两种成体细胞与丝素蛋白纤维的粘附性及增殖情况；体内实验部分将丝素蛋白纤维材料移植到小鼠背上,在移植后的第3、4个月取材,采用HE染色观察材料的降解情况；将CM-Dil荧光标记的两种成体干细胞移植到RSF材料上,并移植到急性肝损伤小鼠模型肝脏表面,在不同时间点(2天、5天、7天、14天、1个月)用小动物活体显像技术及荧光显微镜观察移植细胞的在材料上的定植情况,同时采用HE染色的方法观察不同时间点(2天、5天、7天、14天、1个月、2个月、3个月)移植细胞材料在肝脏表面的定植、分化情况以及RSF材料与肝脏组织的相容性。3.采用CC14 (0.5ml/kg,100ul/20g体重)腹腔注射法构建小鼠急性肝损伤模型；采用荧光追踪技术观察经尾静脉移植到小鼠体内的CM-Dil标记的两种成体干细胞,并将分别两种成体干细胞与材料复合后移植到肝脏表面,采用全自动生化分析仪检测实验组和对照组(N=5只)小鼠肝功能,并采用HE染色法不同实验组和对照组肝脏组织学的改变。4.统计学方法：采用SPSS19.0统计软件,用T检验、单因素所方差分析对统计数据进行分析,P0.05具有统计学意义。结果1.采用胶原酶I培养的ADSCs和骨片法培养的BMSCs细胞均呈长梭形,旋涡状生长,两者形态基本一致。两种成体干细胞增殖曲线均呈“S”型,CCK8检测增殖活性无统计学差异(P0.05)；两种成体干细胞表型均表达CD90.2、CD29,不表达CDllb、CD45,无统计学差异；两种成体干细胞经诱导后均出现脂滴和骨结节。RT-PCR检测结果显示相比于对照组细胞,两个实验细胞组高表达ALB、AFP、 CK18、CK19、CYP1A1肝细胞相关基因；Western蛋白定量的结果显示：与对照组相比,两种成体干细胞中ALB、AFP、CK18、CK19、CYP1A1的蛋白表达量均升高,无明显差异。成肝诱导后细胞免疫荧光显色提示两种细胞均检测到组ALB、 AFP、CK18、CK19、CYP1A1的表达。2.体外实验部分：HE染色可见细胞均匀分布于材料表面,材料内部也有少许细胞；扫描电镜显示两种成体干细胞在RSF材料上呈旋涡状生长,形态基本不变,粘附性良好；激光共聚焦细胞活体3D成像结果显示两种不同成体干细胞在材料不同层面上均可以生长。体内实验部分：小鼠背部丝素蛋白材料移植后第3、4个月HE染色显示材料与组织相容性良好；小动物活体显像和荧光显微镜观察显示CM-Dil荧光标记的两种成体干细胞-丝素蛋白纤维复合材料移植后的2天、5天、7天、14天和1个月均能检测到CM-Dil荧光标记的两种成体干细胞;HE染色结果显示在成体干细胞-RSF复合材料移植的2天、5天、7天、14天、1个月、2个月、3个月材料与肝组织间相容性良好,无大量炎症细胞浸润,移植在背部的RSF材料在第4个月几乎完全降解,移植在肝脏的RSF材料在第3个月几乎完全降解；此外,在第5天和第7天发现材料有新生血管生成,在2个月和3个月观察到新生的肝脏样细胞。3.成功构建了小鼠急性肝衰的动物模型；细胞移植组小鼠存活状况好于CC14注射组。荧光示踪技术显示经尾静脉移植的两种成体干细胞均能在肝脏定植,在移植的第1天、2天、3天、7天均可在肝脏检测到荧光标记的细胞,第3天数量达到最大,第7天标记的细胞数量减少。肝功能检测显示：在第1天、2天、3天细胞治疗组和细胞-材料治疗组均显示出了对急性肝损伤小鼠肝功能的救治作用,而细胞-材料治疗组肝功能改善作用最好,在第7天,所有小鼠肝功能基本恢复正常；HE染色显示：治疗组肝细胞脂肪样变性和肝小叶中央静脉的淤血坏死区域有不同程度的改善。结论1.两种成体干细胞具有类似的体外的增殖能力,且均能有效地诱导成为肝脏样细胞;ADSCs取材容易,不涉及伦理问题,原代即增殖迅速,短期内可获得大量细胞,因此是生物人工-肝的种子细胞的优良选择。2. ADSCs和BMSCs均可较好的在在RSF材料能够粘附、增殖,并且两者具有良好的生物相容性。说明可能两种成体干细胞-RSF材料是一种良好的生物人工肝备选支架材料。3.单纯的两种成体干细胞移植组和两种成体干细胞-RSF材料组均能改善急性肝损伤小鼠的肝功能,两种成体干细胞-RSF材料组治疗效果更为明显,提示两种成体干细胞-RSF材料是一种理想的生物人工肝支持系统。
【关键词】：成体干细胞 ADSCs BMSCs RSF材料 急性肝损伤小鼠模型
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R657.3;R318.14
【目录】：

• 缩略词表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-13
• 前言13-16
• 第一部分：小鼠成体干细胞的体外增殖能力及向肝脏样细胞分化能力的比较研究16-37
• 前育16
• 实验材料16-20
• 实验方法20-25
• 实验结果25-35
• 讨论35-37
• 第二部分：成体干细胞与丝素蛋白纤维相容性研究及体外诱导成肝能力比较37-56
• 前言37-38
• 实验材料38
• 实验方法38-42
• 实验结果42-54
• 讨论54-56
• 第三部分：成体干细胞复合丝素蛋白纤维移植治疗急性肝损伤模型的实验研究56-67
• 前言56-57
• 实验材料57
• 实验方法57-59
• 结果59-65
• 讨论65-67
• 参考文献67-73
• 文献综述73-81
• 参考文献76-81
• 攻读学位期间发表文章81-82
• 致谢82

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本文编号：984797