氧化应激下RPE细胞外泌体对RPE细胞Akt、VEGF-A表达的影响

发布时间：2017-10-12 10:50

  本文关键词：氧化应激下RPE细胞外泌体对RPE细胞Akt、VEGF-A表达的影响

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【摘要】：目的本研究通过分离提取氧化应激状态下视网膜色素上皮细胞(Retinal Pigment Epithelium cells,RPE)分泌的外泌体(exosome),探索分析此外泌体对于正常RPE细胞增殖及细胞因子VEGF-A、Akt的影响,为RPE细胞外泌体与年龄相关性黄斑变性(AMD)发病机制的相关性提供实验依据。方法1、培养人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19),收集上清液,通过3种方法分离提取外泌体:超速差速离心法、Exosome提取试剂盒(SBI)、size exclusion qEV法,透射电镜下观察外泌体形态,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测外泌体表面特异性标志蛋白CD63。细胞培养基中分别加入浓度为0、1、2.5、5μmol/L鱼藤酮模拟氧化应激损伤,观察分析不同浓度鱼藤酮对细胞增殖情况的影响。2、选定2.5μmol/l鱼藤酮诱导ARPE-19细胞损伤,制备氧化应激损伤下ARPE-19-exosome。外泌体与正常ARPE-19细胞共培养,采用MTT法检测细胞增殖活力。Western blot法、免疫荧光检测共培养后ARPE-19细胞中细胞因子Akt、VEGF-A在蛋白水平表达的变化。RT-PCR检测共培养后ARPE-19细胞的VEGF-A、Akt mRNA的表达。统计方法:实验数据使用SPSS18.0软件进行统计分析。所有计量资料数据均采用均数±标准差表示,MTT实验各组的总体差异采用单因素方差分析,组间比较采用LSD-t检验,其余两组组间比较采用配对样本t检验,p0.05认为差异具有显著性。结果1、正常ARPE-19细胞分泌的外泌体,形态呈圆形或近似圆形的小囊泡,直径在50-150nm之间。蛋白质免疫印迹法结果显示,外泌体表达表面特异性标记蛋白CD63。MTT比色法检测细胞增殖能力结果显示鱼藤酮对ARPE-19细胞增殖有抑制作用,随鱼藤酮浓度增加,抑制作用增大,差异具有显著性(p0.05)。2、选取2.5μmol/L鱼藤酮成功诱导ARPE-19细胞氧化应激损伤,ARPE-19-exosome与正常ARPE-19细胞共培养后,MTT法检测与对照组相比,发现其对细胞增殖有抑制作用,差异有显著性(p=0.002)。荧光显微镜下观察,胞浆内的绿荧光,与对照组相比,VEGF-A表达较强,Akt表达较弱。Western blot实验结果显示氧化应激作用下ARPE-19-exosome处理组细胞因子Akt表达低于对照组(p=0.003),细胞因子VEGF-A表达高于对照组(p=0.001),差异有显著性(p0.05)。RT-PCR结果显示,VEGF-A mRNA表达实验组(2.37±0.43)高于对照组(0.54±0.07),Akt mRNA表达实验组(0.64±0.11)低于对照组(3.05±0.58),差异具有显著性(p0.05)。结论ARPE-19细胞分泌具有生物学功能的外泌体,氧化应激作用下ARPE-19细胞分泌外泌体可抑制正常AREP-19细胞的增殖,上调VEGF-A的表达,下调Akt的表达。
【关键词】：外泌体 视网膜色素上皮细胞 氧化应激 VEGF-A Akt
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R774.5
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语11-13
• 前言13-16
• 研究现状、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、氧化应激状下ARPE-19外泌体制备16-28
• 1.1 对象和方法16-22
• 1.1.1 对象16-18
• 1.1.1.1 细胞来源16
• 1.1.1.2 主要仪器16
• 1.1.1.3 主要试剂16-17
• 1.1.1.4 主要试剂的配置17-18
• 1.1.2 方法18-22
• 1.1.2.1 正常ARPE-19细胞的培养18-19
• 1.1.2.1.1 细胞复苏18
• 1.1.2.1.2 细胞培养及传代18
• 1.1.2.1.3 细胞冻存18-19
• 1.1.2.2 正常ARPE-19细胞外泌体的分离提取19
• 1.1.2.2.1 超速差速离心法19
• 1.1.2.2.2 Exosome提取试剂盒(SBI)19
• 1.1.2.2.3 Exclusion qEV法19
• 1.1.2.3 外泌体的鉴定19-21
• 1.1.2.3.1 透射电镜观察外泌体形态19-20
• 1.1.2.3.2 Western blot法检测外泌体表面特异标志蛋白CD6320-21
• 1.1.2.4 鱼藤酮诱导ARPE-19细胞氧化应激损伤21-22
• 1.1.3 统计学分析22
• 1.2 结果22-24
• 1.2.1 正常ARPE-19细胞形态22
• 1.2.2 正常ARPE-19细胞外泌体形态特征及鉴定结果22-23
• 1.2.3 不同浓度鱼藤酮对ARPE-19细胞增殖的影响23-24
• 1.3 讨论24-27
• 1.3.1 外泌体的生物学特征24-26
• 1.3.2 视网膜色素上皮细胞与氧化应激26-27
• 1.4 小结27-28
• 二、氧化应激下ARPE-19细胞外泌体对其Akt、VEGF-A影响28-41
• 2.1 对象和方法28-32
• 2.1.1 对象28-29
• 2.1.1.1 材料28
• 2.1.1.2 主要仪器28
• 2.1.1.3 主要试剂28-29
• 2.1.1.4 主要试剂的配置29
• 2.1.2 方法29-32
• 2.1.2.1 氧化应激下ARPE-19细胞外泌体的制备29
• 2.1.2.2 BCA法检测外泌体浓度29-30
• 2.1.2.3 外泌体与ARPE-19细胞共培养30
• 2.1.2.4 MTT法检测细胞增殖活力30
• 2.1.2.5 免疫荧光染色检测Akt与VEGF-A的表达30
• 2.1.2.6 Western blot法检测Akt与VEGF-A的表达30
• 2.1.2.7 RT-PCR检测Akt与VEGF-A的表达30-32
• 2.1.3 统计学分析32
• 2.2 结果32-36
• 2.2.1 外泌体共培养后ARPE-19细胞形态32-33
• 2.2.2 MTT检测细胞增殖能力33
• 2.2.3 细胞免疫荧光检测ARPE-19细胞中Akt及VEGF-A的表达33-35
• 2.2.4 western blot检测外泌体对Akt、VEGF-A蛋白表达的影响35
• 2.2.5 RT-PCR检测ARPE-19细胞中Akt与VEGF-A的表达35-36
• 2.3 讨论36-40
• 2.3.1 AMD与氧化应激36-37
• 2.3.2 AKT与VEGF-A的生物学特性37-39
• 2.3.3 外泌体的免疫调节作用39-40
• 2.4 小结40-41
• 全文结论41-42
• 参考文献42-49
• 发表论文和参加科研情况说明49-50
• 综述 外泌体在年龄相关性黄斑变性发病机制中的研究进展50-58
• 综述参考文献54-58
• 致谢58-59
• 个人简历59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 梁厚成;陈凌;冯海晓;何玲;姚亮;柏凌;;视网膜色素上皮细胞氧化应激相关microRNA的鉴定[J];国际眼科杂志;2015年09期

2 廖志雄;楼正青;肖中;;兔房水来源exosomes的分离与鉴定及其免疫抑制功能的研究[J];浙江大学学报(医学版);2012年03期

3 柏凌;闫欢欢;张德秀;王建明;孙乃学;;氧化应激对人视网膜色素上皮细胞屏障功能的影响及其分子机制研究[J];中华眼科杂志;2012年05期

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本文编号：1018294