RNA干扰MMP-2基因对体外培养的人晶状体上皮细胞增殖及移行作用的研究

发布时间：2017-10-19 14:01

  本文关键词：RNA干扰MMP-2基因对体外培养的人晶状体上皮细胞增殖及移行作用的研究

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【摘要】：目的:首先在体外培养人晶状体上皮细胞株(human lens epithelial cells,h LECs)SRA01/04,然后利用靶向RNA干扰技术转染h LECs,干扰细胞表达基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2),进而观测体外培养的人晶状体上皮细胞的增殖、移行能力的变化。由此说明MMP-2在人晶状体上皮细胞中的作用和影响,进一步论证RNA干扰技术对抗人晶状体上皮细胞移行、增殖的应用可行性,以期更深入的讨论RNA干扰MMP-2对于后发性白内障的抑制作用。方法:首先是通过人工设计、合成一条含有靶向干扰MMP-2基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)的质粒载体,同时设计、合成一条不含MMP-2基因的sh RNA的阴性对照质粒载体;在体外对人晶状体上皮细胞SRA01/04细胞株进行培养;利用上述质粒转染人晶状体上皮细胞,分别标注为MMP-2沉默组、阴性对照组,同时以等体积的培养液替代转染质粒进行细胞培养,标记为空白对照组;采用实时荧光定量PCR和Western blot技术手段分别对细胞转染24h后的MMP-2m RNA及MMP-2蛋白的相对表达量进行检测;采用MTT比色法测定不同时间点,即转染后24h,48h及72h时的人晶状体上皮细胞的相对增殖能力;最后以细胞划痕实验方法测量细胞转染24h和48h时的人晶状体上皮细胞的划痕宽度,并计算得出细胞的移行愈合率。结果:人晶状体上皮细胞经过转染24h后,通过测算,MMP-2沉默组的m RNA相对表达量为0.202±0.075,空白对照组的表达量1.041±0.163,两者相比MMP-2沉默组下降了80.6%,差异有统计学意义(P0.05),而MMP-2沉默组的MMP-2蛋白相对表达量为80.856±2.165,与空白对照组的184.419±3.584比较下降了55.1%,有统计学意义(P0.05),阴性对照组与空白对照组比较无论m RNA或是MMP-2的表达上差异均无统计学意义(P0.05);MTT比色法的结果表明,转染后随着时间的延长,细胞的增殖能力增高,但在各时间点MMP-2沉默组与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P0.05),同时这两组较空白对照组的细胞增殖能力均有所下降,差异有统计学意义(P0.05);另外,通过细胞划痕实验表明,细胞转染24h后MMP-2沉默组、空白对照组、阴性对照组的移行愈合率分别为0.2036±0.0414、0.4126±0.0457以及0.3628±0.0228,转染48h后该三组移行愈合率分别为0.2319±0.0562,0.6761±0.0880,0.7448±0.0921,MMP-2沉默组细胞移行愈合率明显低于空白对照组及阴性对照组,差异有统计学意义(P0.05),而阴性对照组与空白对照组之间比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论:本实验利用干扰MMP-2表达的sh RNA能够有效降低人晶状体上皮细胞SRA01/04的MMP-2 m RNA和蛋白表达量,抑制细胞的移行能力,但对细胞增殖能力的影响尚不明确。RNA干扰MMP-2的表达能够达到抑制人晶状体上皮细胞移行的作用,这为通过基因手段防治后发性白内障的提供了理论依据、开拓了新的思路。
【关键词】：人晶状体上皮细胞 基质金属蛋白酶-2 RNA 干扰
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R776
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本文编号：1061486