骨髓间充质干细胞及其培养上清液对小鼠角膜碱烧伤修复作用的实验研究

发布时间：2017-10-28 02:00

  本文关键词：骨髓间充质干细胞及其培养上清液对小鼠角膜碱烧伤修复作用的实验研究

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【摘要】：目的:角膜碱烧伤是临床上常见的致盲性眼外伤。目前对于该病主要的有药物和手术两种治疗方法。这些治疗方法虽然取得了一定的疗效,但是在减轻碱烧伤后角膜混浊度,减轻角膜炎症反应和减少角膜新生血管方面的效果仍有待提高。骨髓间充质干细胞因其较强的增殖能力和多向分化潜能,加之潜在的抗炎和抗新生血管作用,成为了组织损伤疾病细胞治疗方法的理想种子细胞来源。骨髓间充质干细胞是否对于角膜碱烧伤具有一定的治疗作用,骨髓间充质干细胞培养上清液是否也具有治疗作用,目前国内外对于其在小鼠角膜碱烧伤方面的研究较少。本实验建立并验证了一种稳定可重复的小鼠角膜碱烧伤模型,并在此基础上探讨了应用结膜下注射骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞培养上清液点眼两种治疗方法对于角膜碱烧伤的治疗效果。方法:1.利用浸润于Na OH溶液的单层滤纸片贴附于小鼠角膜中央进行角膜碱烧伤,通过造模后裂隙灯检查眼表情况和HE染色检查,比较不同浓度Na OH溶液和不同滤纸片贴附时间下角膜碱烧伤的作用效果,从而选择一种相对稳定性强,一致性好的小鼠角膜碱烧伤动物模型制作方法。2.获得稳定可重复的小鼠角膜碱烧伤模型后,将实验小鼠分为三组:分别是碱烧伤后给予球结膜下注射0.1ml含1×106个BMSCs的悬浮液的骨髓间充质干细胞治疗组;碱烧伤后每天给予6次骨髓间充质干细胞培养上清液点眼组;以及碱烧伤后每天给予6次PBS液点眼组。结膜下注射骨髓间充质干细胞组为碱烧伤造模后进行注射,点眼组为每天6次点眼,直至处死小鼠。3.造模后裂隙灯观察眼表情况变化:造模后早期第1天、第3天、第5天、第7天利用荧光素染色法观察角膜上皮愈合情况;造模后第3天、第7天、第14天、第21天、第28天观察角膜新生血管情况;造模后第3天、第7天、第14天、第21天、第28天进行中央角膜混浊度评分,共观察4周。4.造模后第3天、7天、14天和28天,通过HE染色法观察角膜组织变化情况、炎症反应和新生血管生成情况,并对中央角膜的基质细胞进行计数。5.造模后第28天,通过免疫组织化学染色法检测角膜组织中Ki-67、α-SMA、MMP-9的表达。研究结果:1.利用浸润于1mol/L Na OH溶液的单层滤纸片贴附于小鼠中央角膜10s,可建立深浅适度、可重复性强的小鼠角膜碱烧伤动物模型。2.角膜碱烧伤后球结膜下注射骨髓间充质干细胞和角膜碱烧伤后骨髓间充质干细胞培养上清液点眼,都具有促进角膜上皮修复的作用。造模后1天、3天、5天、7天,应用PBS点眼的对照组角膜上皮缺损面积大于另外两个治疗组,差异具有统计学意义。3.角膜碱烧伤后球结膜下注射骨髓间充质干细胞和角膜碱烧伤后骨髓间充质干细胞培养上清液点眼,两种治疗方法都在一定程度上具有减少角膜新生血管生成的作用。造模后3天、7天、14天、21天、28天,应用PBS点眼的对照组新生血管面积大于另外两个治疗组,差异具有统计学意义。4.角膜碱烧伤后球结膜下注射骨髓间充质干细胞和角膜碱烧伤后骨髓间充质干细胞培养上清液点眼,两种治疗方法都具有改善角膜混浊程度的作用。造模后3天、7天、14天、21天、28天,应用PBS点眼的对照组角膜混浊度评分大于另外两个治疗组。5.通过HE染色观察显示,与两个治疗组相比,PBS液点眼组角膜上皮愈合较慢,新生角膜上皮层数较少,基质细胞排列较紊乱,炎性细胞浸润和新生血管生成相对较多。而碱烧伤后28天两个治疗组角膜基质层胶原排列较规则,无炎性细胞浸润,新生血管较少。角膜基质细胞计数显示球结膜下注射骨髓间充质干细胞组和骨髓间充质干细胞培养上清液点眼组细胞数量低于PBS液点眼组,差异具有统计学意义。6.免疫组织化学检查显示,PBS点眼组角膜基质层的α-SMA和MMP-9表达阳性度较高,而该组在角膜上皮层基底细胞的Ki-67阳性度低于另外两组。结论:结膜下注射骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞培养上清液点眼两种方法都对碱烧伤后的小鼠角膜具有修复作用。局部应用的骨髓间充质干细胞和其培养上清液能够改善碱烧伤后角膜透明度,促进角膜上皮愈合并能够相对抑制角膜新生血管的形成。
【关键词】：角膜碱烧伤 基质细胞 骨髓间充质干细胞 骨髓间充质干细胞培养上清液 新生血管 角膜混浊
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R772.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、小鼠角膜碱烧伤模型的建立方法和验证15-36
• 1.1 对象和方法15-21
• 1.1.1 实验动物15
• 1.1.2 试剂及耗材15-16
• 1.1.3 实验所需的主要试剂及溶液的配制16-17
• 1.1.4 主要仪器设备17-18
• 1.1.5 实验方法18-21
• 1.1.6 统计学方法21
• 1.2 结果21-31
• 1.2.1 小鼠全身和眼部的一般情况21-22
• 1.2.2 小鼠角膜碱烧伤模型的建立22-30
• 1.2.3 小鼠角膜碱烧伤模型的验证30-31
• 1.3 讨论31-35
• 1.3.1 角膜碱烧伤模型的选择31-32
• 1.3.2 角膜碱烧伤的损伤机制32-35
• 1.4 小结35-36
• 二、结膜下注射骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞培养上清液点眼对碱烧伤后小鼠角膜的影响36-66
• 2.1 对象和方法36-41
• 2.1.1 实验动物36
• 2.1.2 骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞培养上清液36
• 2.1.3 试剂及耗材36-38
• 2.1.4 实验所需的主要试剂及溶液的配制38
• 2.1.5 主要仪器设备38
• 2.1.6 实验方法38-41
• 2.1.7 统计学方法41
• 2.2 结果41-62
• 2.2.1 结膜下注射骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞培养上清液点眼有助于角膜上皮愈合41-48
• 2.2.2 结膜下注射骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞培养上清液点眼有助于碱烧伤后角膜新生血管的生成48-57
• 2.2.3 结膜下注射骨髓间充质干细胞和骨髓间充质干细胞培养上清液点眼有助于减轻角膜碱烧伤后角膜混浊57-58
• 2.2.4 HE染色检查角膜组织结构变化58-61
• 2.2.5 免疫组织化学染色检查角膜组织结构变化61-62
• 2.3 讨论62-65
• 2.3.1 间充质干细胞的主要特征62-63
• 2.3.2 骨髓间充质干细胞对碱烧伤后早期角膜上皮愈合的影响63-64
• 2.3.3 骨髓间充质干细胞对碱烧伤后角膜炎症反应的影响64
• 2.3.4 骨髓间充质干细胞对碱烧伤后角膜新生血管的影响64-65
• 2.3.5 骨髓间充质干细胞的应用途径65
• 2.4 小结65-66
• 结论66-67
• 参考文献67-74
• 发表论文和参加科研情况说明74-77
• 综述 骨髓间充质干细胞在角膜损伤修复方面的研究进展77-95
• 综述参考文献86-95
• 致谢95-96
• 个人简历96

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 Nese Tuncel;Nilgun Yildirim;Firdevs Gurer;Hikmet Basmak;Kubilay Uzuner;Varol Sahinturk;Huseyin Gursoy;;Effect of vasoactive intestinal peptide on the wound healing of alkali-burned corneas[J];International Journal of Ophthalmology;2016年02期

2 Aline Lütz de Araujo;José lvaro Pereira Gomes;;Corneal stem cells and tissue engineering: Current advances and future perspectives[J];World Journal of Stem Cells;2015年05期

3 史伟云;谢立信;;我国角膜病领域的学术发展方向[J];中华眼科杂志;2014年09期

4 修立恒;曾小平;;眼碱烧伤的治疗现状[J];遵义医学院学报;2012年06期

5 卞丹梅;顾宏卫;胡楠;;骨髓间充质干细胞移植对角膜化学伤后炎症和血管生成相关因子表达的影响[J];中华实验眼科杂志;2012年03期

6 孙江森;李彪;龚跃昆;;骨髓间充质干细胞标记及示踪技术的研究与进展[J];中国组织工程研究;2012年06期

7 宋秀君;;重视角膜基质细胞的作用[J];中华实验眼科杂志;2011年12期

8 施文建;侯光辉;吴静;徐锦堂;;种植人骨髓间充质干细胞的猪角膜板层移植治疗兔角膜损伤的初步研究[J];眼科研究;2010年04期

9 刘国华;晏晓明;杨松霖;李海丽;;骨髓间充质干细胞移植重建碱烧伤眼表的实验研究[J];眼科研究;2008年11期

10 张奕霞;张明昌;;吡格列酮对鼠角膜碱烧伤后新生血管抑制作用的研究(英文)[J];国际眼科杂志;2007年05期

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本文编号：1106128