EB病毒衣壳抗原（VCA）IgA及核抗原1（NA1）IgG时间分辨荧光免疫定量检测试剂的研制

发布时间：2017-11-01 17:19

  本文关键词：EB病毒衣壳抗原（VCA）IgA及核抗原1（NA1）IgG时间分辨荧光免疫定量检测试剂的研制

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【摘要】：研究背景及目的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方及东南亚地区较为常见的恶性肿瘤之一,好发于广东、广西、福建、湖南、香港、台湾等及东南亚一些国家。鼻咽癌多侵犯35～50岁的中老年人群,占总患病人数的60%,青少年则少见。据世界卫生组织(world health organization,WHO)统计,大约80%的鼻咽癌发生在中国,严重危害人民的健康和生命安全,是中国重点防治的恶性肿瘤之一。2003～2007年中国鼻咽癌的发病率为4.20/10万人,死亡率为2.24/10万人。珠江流域发病率在10/10万人以上。中国鼻咽癌年平均死亡率,男性为2.49/10万人,女性为1.27/10万人,南方5省年平均死亡率为4.35/10万人。鼻咽癌的发生与环境、遗传、病毒三者作用相关。鼻咽癌是第一个被发现与EB病毒感染有关的人类癌症。研究证实未分化型鼻咽癌与EB病毒感染密切相关。鼻咽癌早期通常无明显症状且肿瘤好发部位比较隐匿,确诊往往受到延误,因而令病人错过治疗的最佳时机。研究表明,鼻咽癌首诊时的误诊率高达86.98%,因而对鼻咽癌的早期诊断是非常有必要。鼻咽癌5年生存率Ⅰ、Ⅱ期可高达60%以上,而Ⅲ、Ⅳ鼻咽癌则下降至20%-40%。可见鼻咽癌早期诊断是提高治疗效果、争取良好预后的关键。近年来的研究表明,与EB病毒感染相关的免疫血清学与生物学标志产物作为鼻咽癌早期筛查、辅助诊断、临床分期、疗效判断和预后预测有着独特的优势。EB病毒归类为疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科嗜淋巴病毒属,可引起两种不同类型的感染,即增殖性感染和非增值性感染。EB病毒感染与人类多种疾病发生、发展有密切联系。包括传染性单核细胞增多症和B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤等免疫细胞性疾病；鼻咽癌、胃癌等上皮细胞性疾病。VCA (viral capsid antigen)为病毒衣壳抗原。文献报道,血清EB病毒VCA-IgA抗体可以在鼻咽癌发生前10-61个月出现。患者的EB病毒抗体在高滴度水平波动,预示疾病进一步发展,提示其可能作为鼻咽癌早期诊断和鉴别诊断的标志物。在将来的鼻咽癌筛查计划中,将VCA-IgA抗体阳性者作为严密监测的人群,进行更密切的随访和严格的临床检查是十分必要的。血清中EB病毒VCA-IgA也可能作为评价鼻咽癌疗效和监测复发的观测指标。EBNA1 (nuclear antigen 1)见于所有类型的潜伏性感染,是惟一在病毒相关肿瘤细胞中均有表达的蛋白,是病毒成功建立潜伏性感染的必要条件,它与病毒基因复制和维持病毒颗粒的稳定性有关。EBNA1-IgG于发病后3-4周出现,2-3月后达到高峰,然后滴度稍稍降低至较高水平并持续终生,是既往感染的标记。有研究表明,在鼻咽癌病人中抗EBNA1抗体可升高10倍。在鼻咽癌的发展中,抗EB病毒血清标志物主要起到短期风险预测作用,通过普查检测VCA-IgA及NA1-IgG抗体水平,可提高鼻咽癌筛查的早诊率,降低死亡率。检测血清抗EB病毒抗体水平,已在临床上常规应用于鼻咽癌的血清学诊断。病毒分离为“金标准”,但费时耗力,临床应用较少。临床大量使用血清学检查。近年来,随着检验技术的发展及对鼻咽癌认识的提高,检测EB病毒以辅助诊断鼻咽癌的方法越来越多。如免疫荧光和免疫酶法、酶中和分析、免疫印迹、免疫斑点、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)和实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)等。目前鼻咽癌的辅助诊断方法中,ELISA及PCR检测EB病毒最受重视。ELISA特异性和敏感度均较高；操作简便；判断结果客观；便于原始记录的保存：并可应用于血液中心的自动化检测系统。但是只能对血样进行定性或半定量检测；早期检测方面有限制：不能清楚区分患者处于感染期还是已治愈期；没有足够高的灵敏度。PCR方法可寻找病毒基因组以及其表达产物的存在,直接获得结果,具有灵敏性高：特异性高；定量检测等优点,用于检测病原微生物感染比免疫学更直接和准确。但对设备、时间和技术依赖性比较高,很难普及。因此研制一种更准确、敏感、快速、简易的鼻咽癌诊断、筛查方法将是当今该类技术的发展趋势。时间分辨荧光免疫测定(Timed-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)利用具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物作为标记物标记抗原、抗体、激素、多肽或核酸探针等,待反应体系发生后,用TRFIA检测仪测量荧光,据此判断反应体系中待测物的浓度值,从而达到定量分析。TRFIA具有区别于其他标记免疫技术的优势：灵敏度高(10-18mol/孔)；操作简便；易自动化；标准曲线范围宽；不受样品自然荧光干扰；标记物制备简便且稳定；无放射性污染；可用于多标记等优点。方法(一)采用间接法研制EB病毒衣壳抗原(VCA)IgA时间分辨免疫荧光分析定量检测试剂。1.标准品及质控品的配制：收集高值阳性的血样,混合后用IBL ELISA试剂盒测量三次,所得浓度为血样真实浓度。用样品稀释液配制成A:0 AU/mL, B:0.5 AU/mL,C:1 AU/mL,D:2.5 AU/mL,E:10 AU/mL,F:30 AU/mL六个浓度的系列参考标准品和浓度分别为2.5 AU/mL、10 AU/mL、20 AU/mL的质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。2.固相包被抗原的制备：包被液稀释VCA抗原到2.5μg/mL,100μL孔加入微孔板中,4℃过夜。洗板后每孔加入200μL封闭液,4℃封闭过夜。吸去封闭液后真空抽干,-20℃冷冻保存。3.Eu3+标记抗体的制备及纯化：0.5mg抗人IgA抗体洗涤离心6次,按质量比5：1加入Eu3+标记试剂室温震荡过夜。用分子筛层析柱分离纯化,洗脱液洗脱收集,测量吸光度A280,收集高峰管混合,加入10%BSA保护。4.反应系统的优化4.1最佳包被浓度：选取1.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、2.5μg/mL 3μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL8个浓度梯度进行优化。4.2 Eu3+标记抗体最佳稀释比：选取1：400、1：600、1：800、1：1000、1：1500、1：20006个稀释比梯度进行优化。4.3最佳反应时间的确定：选取20+20 min、40+40min、60+60 min、80+80 min、 100+100 min、120+120min 6个反应时间进行优化。5.参考值范围的确定：自制TRFIA试剂测量317份正常人血清,统计频数分布后制定ROC曲线,统计分析结果并结合文献报道情况确定参考值范围。6.性能指标的评价6.1标准曲线的绘制：由双对数数学模型Log-Log函数处理。6.2线性范围及分析灵敏度实验：平行测定20次A点(零剂量点)的荧光值,计算荧光值的平均值(X)及其标准差(SD),以均值X+2SD的反应量代入上述标准曲线方程,计算分析灵敏度。6.3 HOOK效应：用样品稀释液对标准品进行系列稀释,观察剂量反应饱和浓度点。6.4准确度实验：选择合适浓度的4个常规检测样本1mL,在其中的3份样本中加入不同浓度相同体积(0.1mL)的待测物标准液制备待回收分析样本,在另一份样本中加入同体积的(0.1mL)的样本稀释液,制备成基础样本。对制备好的3份分析样本和一份基础样本进行3次重复实验,计算均值和回收率。6.5精密度实验：三个不同时间各重复测量质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ10次,计算分析间和分析内变异系数(CV)。6.6干扰性实验：称取不同质量的血红蛋白、甘油三酯和胆红素分别加入到质控品Ⅰ、Ⅲ中,使用自制的VCA-IgA检测试剂进行测定,各设3个复孔,计算各测值均数。7.临床考核试验：以中山生物VCA-IgA ELISA检测试剂盒为对照试剂,本项目作为分析试剂,对171例临床样本进行同步检测,用SPSS13.0进行数据分析。(二)采用间接法研制EB病毒核抗原1(NA1)IgG时间分辨免疫荧光分析定量检测试剂。1.标准品及质控品的配制：收集高值阳性的血样,混合后用IBL ELISA试剂盒测量三次,所得浓度为血样真实浓度。用样品稀释液配制成A:0 AU/mL,B:2.5 AU/mL,C:10 AU/mL,D:50 AU/mL, E:200 AU/mL, F:500 AU/mL六个浓度的系列参考标准品和浓度分别为20 AU/mL、100AU/mL、400 AU/mL的质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。2.固相包被抗原的制备：包被液稀释NA1抗原到2.5μg/mL,100μL/孔加入微孔板中,4℃过夜。洗板后每孔加入200μL封闭液4℃封闭过夜。吸去封闭液后真空抽干,-20℃冷冻保存。3.Eu3+标记抗体的制备及纯化：0.5mg抗人IgG抗体洗涤离心6次,按质量比5：1加入Eu3+标记试剂震荡过夜。用分子筛层析柱分离纯化,洗脱液洗脱收集。测量吸光度A280,收集高峰管混合,加入10%BSA保护。4.反应系统的优化4.1最佳包被浓度：选取1.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL 2μ/mL、2.5μg/mL 2μg/mL、3.5μg/mL、4μg/mL8个浓度梯度进行优化。4.2 Eu3+标记抗体最佳稀释比：选取1：100、1：150、1：200、1：300、1：400、1：6008个稀释比梯度进行优化。4.3最佳反应时间的确定：选取20+20 min、40+40min、60+60 min、80+80 min、 100+100 min、120+120min 6个反应时间进行优化。5.性能指标的评价5.1标准曲线的绘制：由双对数数学模型Log-Log函数处理。5.2线性范围及分析灵敏度实验：平行测定20次A点(零剂量点)的荧光值,计算荧光值的平均值(X)及其标准差(SD),以均值X+2SD的反应量代入上述标准曲线方程,计算分析灵敏度。5.3 HOOK效应：用样品稀释液对标准品进行系列稀释,观察剂量反应饱和浓度点。5.4准确度实验：选择合适浓度的4个常规检测样本1mL,在其中的3份样本中加入不同浓度相同体积(0.1mL)的待测物标准液制备待回收分析样本,在另一份样本中加入同体积的(0.1mL)的样本稀释液,制备成基础样本。对制备好的3份分析样本和一份基础样本进行3次重复实验,计算均值和回收率。5.5精密度实验：三个不同时间各重复测量质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ10次,计算分析间和分析内变异系数(CV)。5.6干扰性实验：称取不同质量的血红蛋白、甘油三酯和胆红素分别加入到质控品Ⅰ、Ⅲ中,使用自制的NAl-IgG检测试剂进行测定,各设3个复孔,计算各测值均数。6.血清盘实验：用自制TRFIA试剂测量血清盘中7例阴性血清和14例阳性血清。7.临床考核试验：以IBL NAl-IgG ELISA检测试剂盒为对照试剂,本项目作为分析试剂,对148例临床样本进行同步检测,用SPSS13.0进行数据分析。结果(一)采用间接法研制EB病毒衣壳抗原(VCA)IgA时间分辨免疫荧光分析定量检测试剂。本研究所建立的衣壳抗原(VCA) IgA TRFIA间接法的标准品六个点的浓度分别为A:OAU/mL、B:0.5AU/mL、C:1AU/mL、D:2.5AU/mL、E:10AU/mL、 F:30AU/mL;最佳包被浓度、最佳Eu3+标记抗体稀释比、最佳反应时间分别为2.5μg/mL、1:1000、60+60min;cut off值为2.20AU/mL;分析灵敏度及线性范围分别为0.029AU/mL和0.029-30 AU/mL；大于100AU/mL出现HOOK效应；回收率在89.44%～97.81%之间；分析间和分析内变异系数(CV)均小于10%；对血红蛋白、甘油三酯和胆红素血无交叉反应；与商业化ELISA试剂盒在灵敏度和特异性上无统计学差异。(二)采用间接法研制EB病毒核抗原1(NA1)IgG时间分辨免疫荧光分析定量检测试剂。本研究所建立的核抗原1(NA1)IgG TRFIA间接法的标准品六个点的浓度分别为A:0AU/mL、B:2.5AU/mL、C:10AU/mL.D:50AU/mL.E:200AU/mL、 F:500AU/mL;最佳包被浓度、最佳Eu3+标记抗体稀释比、最佳反应时间分别为2.5μg/mL?1:200、60+60min;分析灵敏度及线性范围分别为0.162AU/mL和0.162～500AU/mL;大于1765AU/mL出现HOOK效应；回收率为在106.50%-111.77%之间;分析间和分析内变异系数(CV)均小于10%；对血红蛋白、甘油三酯和胆红素血无交叉反应；血清盘测试与血清盘上阴阳性说明(7例阴性、14例阳性)相符；与商业化ELISA试剂盒在灵敏度和特异性上无统计学差异。结论上述结果表明本研究研制的EB病毒衣壳抗原(VCA)IgA及核抗原1 (NA1)IgG时间分辨荧光免疫定量检测试剂的各项指标(灵敏度、准确度、精密度、特异性等)均达到临床检测试剂要求,与同类ELISA产品性能相近,有望经进一步优化后应用于生产。
【关键词】：时间分辨荧光免疫分析(TRFIA) 鼻咽癌(NPC) EB病毒衣壳抗原(VCA)IgA EB病毒核抗原1(NA1)IgG 检测
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-30
• 第一章 EB病毒衣壳抗原(VCA)-IgA定量检测时间分辨免疫荧光分析检测试剂的研制30-49
• 1 实验材料30-32
• 2 实验方法32-36
• 3 结果36-46
• 4 讨论46-49
• 第二章 EB病毒核抗原1(NA1)-IgG定量检测时间分辨免疫荧光分析检测试剂的研制49-65
• 1 实验材料49-51
• 2 实验方法51-55
• 3 结果55-61
• 4 讨论61-65
• 参考文献65-70
• 中英文缩略词70-72
• 硕士期间论文发表情况72-73
• 致谢73-74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 姜秀文,魏莲枝;鼻咽癌的临床特点和误诊分析[J];重庆医学;2005年03期

2 李桂源;刘华英;周鸣;周后德;李小玲;;鼻咽癌癌变的分子机理[J];生物化学与生物物理进展;2006年10期

3 邓伟;黄天壬;陈万青;张思维;郑荣寿;利基林;;中国2003—2007年鼻咽癌发病与死亡分析[J];肿瘤;2012年03期

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本文编号：1127787