基于羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米载体的miR96内耳递送初步研究

发布时间：2017-11-29 02:00

  本文关键词：基于羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米载体的miR96内耳递送初步研究

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【摘要】：背景感音神经性耳聋是由于耳蜗毛细胞、听神经或听觉中枢病变,对声音的感受或神经冲动的传导发生障碍引起的听力下降。大部分感音神经性耳聋是由耳蜗感觉神经上皮毛细胞的结构或功能异常引起的,而哺乳动物损伤的毛细胞不可自主再生。最根本的治疗方法是通过干预促进异常毛细胞修复或死亡毛细胞再生。随着基因技术的发展,研究者发现约30424个成熟miRNA参与几乎所有细胞的增殖、分化、生长发育过程,多种miRNA在小鼠耳蜗中高表达，其中miRNA 183家族被证实与耳蜗毛细胞的分化、发育及人类听力损失密切相关。RNA干扰主要是通过miRNA实现特定基因沉默。选择合适的载体将1miRNA递送至内耳是实现RNA干扰的关键。病毒载体和非病毒载体是目前常用的miRNA载体,病毒载体有诱发免疫反应、潜在致癌等风险,使其在体应用中受限。近年来,非病毒载体逐渐成为研究热点,其中,纳米载体以其无免疫原性、可生物降解性及生物相容性等优势,成为较理想的miRNA载体。阳离子脂质体(Lipo)由于其高转染率是目前最常用的非病毒性miRNA载体,但由于其自身带有正电荷,细胞毒性较大,并且无靶向性和缓释特性,因此无法实现应用于临床。羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米裁体(CTNs),是由羧甲基化的壳聚糖与TAT蛋白转导肽通过自组装方式合成的纳米颗粒。羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMC)有良好的生物相容性及几乎无毒性,产物无毒、可被生物体吸收,且可溶于水,是一种具有PH感应性的两性聚合材料。TAT蛋白转导肽是人类免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)编码的带正电荷多肤,可以通过共价结合或静电作用高效稳定的结合核酸,其短肽有破膜作用,能够转导不同的外源生物大分子通过生物膜和生理屏障,达到高转染率。CTNs不但有高效转染的特性,而且在酸性环境中,表面负电荷转变为正电荷,提高内含体逃逸能力,达到高效转染、靶向缓释的目的。目前脂质体是内耳递送miRNA最常用的非病毒载体,尽管CTNs已成功用于miRNA转染肿瘤细胞,并能够实现相应的功能调控,但其用于内耳递送1miRNA研究未见报道。目的构建用于内耳递送miRNA的非病毒纳米载体,以阳离子脂质体作为对照,初步探究羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽纳米载体(CTNs)介导miR96转染293细胞和耳蜗基底膜的效率及安全性,为miR96在内耳的功能研究奠定基础。方法1.通过Lipo与cy3标记的miR96混合制得Lipo-miR96-cy3复合物,设浓度为30nM,50nM,100nM的Lipo-miR96-cy3复合物转染293细胞和耳蜗基底膜,并设空白和miRNA96-cy3为对照组,激光共聚焦显微镜下观察cy3红色荧光分布情况、细胞特异性。2.CMC和TAT蛋白转导肽按1.5mg/1mg(1.5:1)质量比制备获得的CTNs,包封miR96-cy3制备羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽-miR96-cy3 (M-CTNs)复合物。3.用150nM Lipo-miR96-cy3复合物和M-CTNs复合物分别转染293细胞和耳蜗基底膜8小时,并设空白对照组,以Lipo-miR96-cy3复合物转染效率为对照评估M-CTNs复合物的转染效果及细胞特异性,MTT测定比较两种载体的细胞毒性。结果1.Lipo-miRNA96-cy3复合物与293细胞共同作用8小时后,被成功摄取,并且随Lipo-miRNA96-cy3复合物转染浓度的增大,cy3红色荧光阳性细胞数增多,50nM组荧光阳性细胞数明显高于30nM组(t=-10.801, P=0.000), 100nM组荧光阳性细胞数明显高于50nM组(t=11.754,P=0.000),并且单个细胞内荧光强度增强,对照组未见荧光。Lipo-miRNA96-cy3复合物与耳蜗基底膜共同作用8小时后,内外毛细胞、支持细胞、螺旋神经节细胞内均可见红色荧光,并随浓度增大而增强,无明显细胞特异性。2.本部分实验成功制备了CTNs,纳米颗粒平均直径约186.6nm,粒径分布集中,无明显团聚现象。M-CTNs复合物包封率达90%以上,对PH5.5的酸性环境反应灵敏，zeta电位在1小时内由-30.9mV快速升至20mV,具备将负电荷转变为正电荷的质子化特性,为后续研究打下基础。3. Lipo-miR96-cy3复合物和M-CTNs复合物分别转染293细胞和耳蜗基底膜，均表现为Lipo组荧光较M-CTNs组强，但Lipo组荧光呈聚集点状分布,而M-CTNs组荧光呈均匀分布，MTT实验测定M-CTNs组OD值高于Lipo组(t=-4.436,P=0.013)。结论阳离子脂质体(Lipo)介导的miR96的体外转染效率高,但其细胞毒性较大,体内应用受限,羧甲基壳聚糖-TAT蛋白转导肽-miR96-cy3 (M-CTNs)复合物细胞毒性小,内含体逃逸能力高,其介导的miR96的体外转染效率较阳离子脂质体低,使用其进行miR96的体内外转导,仍需进一步优化。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R764.43
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本文编号：1235761