MicroRNA-30b影响大鼠RGCs极性的机制及在糖氧剥夺损伤中的保护作用

发布时间：2017-12-29 06:10

  本文关键词：MicroRNA-30b影响大鼠RGCs极性的机制及在糖氧剥夺损伤中的保护作用　出处：《第三军医大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究背景和意义视神经损伤是临床治疗的难点,探讨其损伤后修复相关问题对于视功能恢复和中枢神经疾病的治疗都有非常重要的意义。以往研究聚焦于视网膜神经节细胞轴突再生,并以此来提高损伤修复,但未取得满意结果。近年来研究发现促进视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)轴突生长的同时,出现了再生纤维投射紊乱,妨碍视觉功能恢复的新问题。有研究认为神经元极性紊乱在其中起到了重要作用,因为神经元极性决定了突触生长方向。而RGCs突触生长方向对其损伤修复过程中指导再生纤维投射有重要意义,因此恢复RGCs极性将是促进视神经修复的新途径。miRNA是调节神经发育的重要因素之一,参与转录后基因表达调控,可能参与控制神经元极性。我们前期研究发现,miR-30b在视神经损伤早期表达迅速升高,在原代培养RGCs中促进其轴突生长,但具体作用机制还不清楚。Sema3A具有指导神经元突起生长的作用,且最近研究发现Sema3A参与调节海马神经元极性,并且通过影响神经元内c GMP/c AMP含量决定神经突起成为轴突或者树突,这提示Sema3A可以调节RGCs极性。而且我们前期研究发现miR-30b对Sema3A表达具有抑制效应。因此我们推测miR-30b通过抑制Sema3A调节RGCs极性。此外,视神经损伤后继发性缺血缺氧是造成RGCs不可逆损失、影响再生修复的重要因素之一,目前认为氧剥夺损伤机制在其中发挥重要作用。近年的研究表明,Micro RNAs(miRNAs)参与机体内稳态的调节,包括机体组织对缺氧的应答反应。尤其miR-30b可以帮助视网膜色素上皮细胞抵抗氧化应激损伤。那么miR-30b是否对糖氧剥夺导致的RGCs损伤发挥保护作用呢?尚需要进一步实验验证。本研究拟通过重组腺相关病毒转染原代培养RGCs调节miR-30b含量,明确miR-30b通过抑制Sema3A表达影响RGCs极性;其次,明确miR-30b在糖氧剥夺损伤中对RGCs的保护作用。为miR-30b在中枢神经损伤修复中的应用提供了新的思路和理论依据。7方法:1、利用体外培养的原代RGCs,分别转染r AAV-miR-30b mimic、r AAV-miR-30b inhibitor和r AAV-miR nc,培养7d后免疫组化双荧光染色标记(Tubulin-Ⅲ/MAP2)区分RGCs轴突和树突。荧光显微镜拍照记录,利用IPP图像分析软件计数轴突/树突长度,结合统计软件分析miR-30b对RGCs极性的影响。2、利用体外培养的原代RGCs,分别转染r AAV-miR-30b mimic、r AAV-miR-30b inhibitor、r AAV-miR nc,以及结合应用Si RNA-Sema3A及Sema3A高浓度组,检测Sema3A下游信号因子。3、将原代培养的细胞采用r AAV-miR nc、r AAV-miR-30b mimic和r AAV-miR-30b inhibitor处理,培养细胞6 d。各组细胞分别进行低氧培养箱(37℃,体积分数5%CO2、17%N2、3%O2)联合低糖(糖浓度为1.0g/L)培养液进行培养以建立原代糖氧剥夺RGCs模型,并与正常培养(37℃、5%CO2)的细胞进行对照。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组细胞活力,采用免疫荧光染色法检测各组细胞中神经元特异性标志物TubulinⅢ的表达,并计算存活RGCs数目。采用Hoechst/PI染色法检测各组细胞的凋亡和坏死情况。主要实验结果和结论:1、上调miR-30b可显著增加原代培养RGCs轴突长度,显著减少树突个数;从而提高RGCs双极性率。反之下调miR-30b对RGCs轴突长度没有显著影响,树突个数没有显著改变。2、在原代培养RGCs中,上调miR-30b可显著降低Sema3A蛋白表达。而干扰Sema3A表达后,Sema3A含量也显著降低。反而下调miR-30b表达量对Sema3A没有影响。上调miR-30b可显著增加PKA活性,降低CRMP-2(T514)含量;同时在原提高Sema3A浓度可显著降低PKA活性,增加CRMP-2(T514)含量。3、在经过糖氧剥夺处理后的原代培养RGCs中,上调miR-30b含量可见TubulinⅢ阳性细胞数量明显增多,细胞活性明显增强,以及细胞凋亡率和死亡率明显降低。但下调miR-30b含量对TubulinⅢ阳性细胞数量没有明显改变。上述研究结果提示:在体外培养的原代RGCs中miR-30b水平升高,可以促进轴突生长,抑制树突生长,有助于维持RGCs双极性特性。这一作用主要通过抑制Sema3A表达,进一步增强PKA活性,降低CRMP-2磷酸化程度来实现的。此外,糖氧剥夺损伤是造成视神经损伤不可逆再生的重要原因,而miR-30b对糖氧剥夺损伤后RGCs活性具有保护作用。因此,我们认为miR-30b的上述特性在促进视神经损伤修复过程中具有重要的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R774.6

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本文编号：1349105