间歇性低氧微环境下自噬调控颏舌肌肌卫星细胞功能及其相关机制的研究

发布时间：2018-01-14 01:27

本文关键词：间歇性低氧微环境下自噬调控颏舌肌肌卫星细胞功能及其相关机制的研究　出处：《第四军医大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(Obstructive sleep apnea hyponea syndrome,OSAHS)是一种普遍的睡眠相关呼吸疾病,主要表现为睡眠期间上呼吸道的反复性阻塞和机体通气障碍。作为OSAHS患者最具代表性的病理学体征,间歇性低氧(Intermittent hypoxia,IH)常引发低氧血症,高碳酸血症等一系列不良后果,是机体代谢性障碍及心血管疾病的潜在高危因素。有研究证实,上呼吸道扩张肌,尤其是颏舌肌功能异常是OSAHS的重要致病诱因,而IH又进一步加重了颏舌肌功能损伤。众所周知,肌卫星细胞(Muscle satellite cells,Mu SCs)是参与骨骼肌损伤修复的主力。然而,长期患有OSAHS的人群却仍难以逆转颏舌肌纤维类型改变及功能异常的情况。因此,我们推测,是否IH对颏舌肌肌卫星细胞产生了异常影响,从而降低了其修复能力。另一方面,作为目前医学研究领域的热点,自噬与众多涉及低氧的疾病紧密相关。低氧可诱发自噬。自噬通常被认为是细胞内环境稳态的重要调节机制。那么自噬与IH导致的颏舌肌功能异常之间是否存在某种相关性呢?为了弄清这一问题,我们试图通过研究IH环境下颏舌肌Mu SCs的自噬活性变化以及自噬对颏舌肌Mu SCs相关功能的影响,从而为深入探索OSAHS发病机制并研发针对颏舌肌功能异常的治疗方法提供新的思路。方法1.应用改良式间歇性低氧舱建立间歇性低氧大鼠模型,并通过血气分析法评估建模成效。2.通过透射电镜、HE染色、免疫组织化学染色以及免疫组织荧光染色等方法观察IH环境下颏舌肌的组织病理学变化。3.采用酶消化法与差速贴壁纯化法进行大鼠颏舌肌Mu SCs原代培养;通过MTT比色法测定细胞生长曲线;利用免疫荧光染色法鉴定细胞种属。4.分别通过成肌、成脂、成骨诱导法检验颏舌肌Mu SCs的多向分化潜能。5.采用三气培养箱模拟IH环境,建立颏舌肌Mu SCs间歇性低氧模型,通过蛋白质印迹法检测不同IH时间下颏舌肌Mu SCs中自噬与凋亡相关蛋白的表达情况,初步探讨IH环境下自噬与凋亡的相关性。从中选出自噬活性峰值时间点,并以此作为后续实验默认IH处理时间。6.采用MTT比色法、蛋白质印迹法以及吖啶橙染色法共同筛选自噬抑制剂氯喹的适宜用药浓度,并以此作为后续实验默认用药剂量,从而在IH环境下建立具有不同自噬活性的颏舌肌Mu SCs模型。7.通过蛋白质印迹法与流式细胞术分别检测不同自噬活性下颏舌肌Mu SCs中凋亡相关蛋白的表达情况及细胞凋亡率。8.通过透射电镜观察不同自噬活性下颏舌肌Mu SCs中线粒体超微结构;采用流式细胞术检测线粒体膜电位。9.使用激光共聚焦显微镜动态监测不同自噬活性下颏舌肌Mu SCs的钙离子水平。结果1.血气分析结果显示,IH组大鼠的血氧饱和度和血氧分压较对照组明显下降,提示间歇性低氧大鼠模型建立成功。2.HE染色结果显示,与对照组相比,IH组大鼠颏舌肌纤维明显肥大,形态改变,肌纤维间距狭窄。透射电镜观察结果显示,与对照组相比,IH组大鼠颏舌肌中线粒体明显肿胀,边界不清,结构异常。免疫组化结果显示,与对照组相比,IH组大鼠颏舌肌中细胞色素c表达显著增加。免疫组织荧光染色结果显示,与对照组相比,IH组大鼠颏舌肌中LC3荧光表达明显上调。3.免疫荧光结果显示:Pax 7蛋白染色阳性,且阳染率达95%以上,说明该细胞符合实验要求,可用于后续研究。4.经多向分化诱导后的细胞鉴定结果显示,颏舌肌Mu SCs能够分化形成肌管、脂滴以及骨性矿化结节。5.蛋白质印迹实验结果显示,与对照组相比,IH环境下的颏舌肌Mu SCs自噬蛋白表达量普遍增加,在6h左右达到峰值,12h左右下降;同时,凋亡蛋白表达量也明显增加,但在1、3、6h之间的蛋白表达量差异不明显,随着时间推移,其在12、24h的表达量显著递增。依实验所需,后续实验以自噬活性峰值点6h作为默认IH时间。6.经MTT比色法、蛋白质印迹法及吖啶橙染色法共同筛选得出,自噬抑制剂氯喹的适宜用药浓度为25μmol/L,且在该浓度下氯喹能够有效抑制IH诱发的自噬。7.蛋白质印迹实验结果显示,与对照组相比,IH组Cyt c、caspase 3蛋白表达明显增加;与IH组相比,IH+氯喹组Cyt c、caspase 3蛋白表达显著提高。流式细胞术结果显示,细胞凋亡率依次为:IH+氯喹组IH组对照组。各组差异有统计学意义。8.透射电镜观察结果显示:对照组线粒体未见明显异常。IH组线粒体肥大肿胀。IH+氯喹组中线粒体皱缩。流式细胞术结果显示,线粒体膜电位高低依次为:对照组IH组IH+氯喹组,各组间差异有统计学意义。9.激光共聚焦动态观测结果显示,细胞内钙离子基础荧光强度依次为:IH+氯喹组IH组对照组,差异有统计学意义。加入KCL刺激后,对照组细胞钙瞬变迅速;与对照组相比,IH组细胞钙瞬变速率降低;与IH组相比,IH+氯喹组细胞钙瞬变迟钝,随后突发荧光异常淬灭。各组间差异有统计学意义。结论1.成功建立间歇性低氧大鼠模型。2.IH能够引起颏舌肌组织损伤,同时触发自噬。3.成功建立了颏舌肌Mu SCs的体外研究模型,且细胞纯度高。4.IH能够诱发颏舌肌Mu SCs的自噬与凋亡。5.适量氯喹能够有效抑制IH环境下颏舌肌Mu SCs的自噬活性。6.在IH环境下抑制自噬活性会增加颏舌肌Mu SCs凋亡率,提示自噬可能具有抑制细胞凋亡,应对IH损伤的保护性机制。7.在IH环境下抑制自噬活性会引起颏舌肌Mu SCs线粒体及细胞功能损伤,提示自噬可能通过影响线粒体功能从而保护细胞以抵御损伤,减少凋亡。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R766

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