miR-497调控CDK6,PlexinA4影响喉鳞状细胞癌生长的实验研究

发布时间：2018-01-20 22:08

  本文关键词： 喉肿瘤 鳞状细胞癌 增殖 miR-497 CDK6 PlexinA4 预后　出处：《天津医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:查询喉鳞状细胞癌micro RNA表达谱,选定miR-497进行研究;研究miR-497和CDK6、Plexin A4在喉鳞癌及癌旁正常黏膜新鲜标本和细胞株中的表达情况及相关性,结合临床病理参数评价它们的临床意义及与预后的关系;利用生物信息学方法预测miR-497下游靶基因,随后验证;研究miR-497对喉鳞癌细胞增殖、克隆、侵袭和细胞周期的影响及CDK6、Plexin A4对喉鳞癌细胞增殖、克隆、侵袭和细胞周期的影响,明确它们的生物学功能。方法:利用qRT-PCR和免疫组织化学方法在喉鳞癌及癌旁正常黏膜新鲜标本中观察miR-497和靶基因CDK6、Plexin A4表达情况;将miR-497和CDK6、Plexin A4表达情况与临床病理参数、术后随访资料相结合,评价它们的临床意义及与预后的关系;通过生物信息学预测miR-497的靶基因CDK6、Plexin A4,利用双荧光素酶报告基因检测的方法验证它们的靶向调控关系;利用基因转染技术将miR-497模拟物转染至喉鳞癌细胞,通过MTT法、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell法、流式细胞术等技术手段,观察miR-497对喉鳞癌细胞生物学功能的影响;通过裸鼠移植瘤模型观察miR-497抑制肿瘤效果;采用RNA干扰技术将CDK6si RNA、Plexin A4si RNA转染至喉鳞癌细胞,通过MTS法观察CDK6si RNA、Plexin A4 si RNA对喉鳞癌细胞增殖的影响;通过过表达实验构建pc DNA3.1(+)CDK6,pc DNA3.1(+)Plexin A4过表达质粒转染至喉鳞癌细胞,通过MTS法观察pc DNA3.1(+)CDK6,pc DNA3.1(+)Plexin A4对喉鳞癌细胞增殖的影响。结果:miR-497喉鳞癌中低表达,在中低分化喉鳞癌中,以及有远处转移的喉鳞癌中miR-497低表达例数在所占百分比显著增高(P0.05),相反,在高分化以及无远处转移组中miR-497低表达例数所占百分比显著降低(P0.05);miR-497的表达情况与年龄、性别、原发部分、T分期、肿瘤大小及术前吸烟均无统计学差异(P0.05)。CDK6及Plexin A4在喉癌中高表达。miR-497与CDK6,Plexin A4表达在喉鳞癌中呈负相关关系。经Kaplan-Meier法行生存分析并进行Log-rank检验,miR-497高表达组患者的预后好于miR-497低表达组,差异有统计学意义(χ2=10.342,P=0.001);Cox回归分析显示miR-497低表达的相对危险度为2.262(95%CI为0.151~0.732,P=0.033),是喉鳞癌患者预后的独立影响因素。野生型(CDK6 Wt 3’-UTR组,plexin A4 Wt 3’-UTR组)荧光活性变化倍数与对照组的荧光活性变化倍数相比,差异有统计学意义(P0.01)。而突变型(CDK6Mut 3’-UTR组,plexin A4 Mut 3’-UTR组)组的荧光活性倍数与对照组的荧光活性变化倍数比较,差异无统计学意义(P0.05)。体外实验中,miR-497 mimics作用Hep-2、TU-212细胞后,细胞生长受到明显抑制,平板克隆形成能力受到遏制,G0/G1细胞数百分比增加,差异均有统计学意义(均P0.05)。体内实验中,miR-497 agomir实验组肿瘤生长速度较NC agomir对照组及Blank空白对照组慢,差异有统计学意义(P0.01)。CDK6 si RNA2以及plexin A4 si RNA2作用Hep-2、TU-212细胞后,细胞生长受到明显抑制,差异均有统计学意义(P0.05)。pc DNA3.1(+)/CDK6以及pc DNA3.1(+)/plexin A4组作用后的Hep-2、TU-212细胞生长受到明显促进,穿过小室的迁移细胞数目明显高于对照组,差异均有统计学意义(均P0.01)。结论:1、miR-497在喉鳞癌中显著下调,具有抑癌基因的作用,而CDK6、PlexinA4在喉鳞癌组织中显著升高,具备癌基因作用。同时伴有miR-497低表达的个体预后不良,且这一分子特征是喉鳞癌患者预后的独立危险因素。2、CDK6,PlexinA4是miR-497的靶基因,miR-497对CDK6、PlexinA4存在靶向调控作用。3、在体外miR-497对于喉鳞癌细胞增殖、克隆、迁移和侵袭有抑制作用,可将细胞周期阻滞于G0/G1期。在体内可以抑制裸鼠皮下荷Hep-2瘤的生长。4、CDK6 si RNA,Plexin A4 si RNA对于喉鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭有抑制作用。5、pc DNA3.1(+)/CDK6和pc DNA3.1(+)/PLEXINA4对于喉鳞癌细胞增殖、侵袭以及克隆形成能力有正向促进作用。并促进喉鳞癌细胞进入S期。6、miR-497通过调控其靶基因CDK6、Plexin A4参与了喉鳞癌的发生发展,为揭示喉鳞癌的发病机制提供新的理论依据,可为喉鳞癌的治疗提供新的分子靶点。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of miR - 497 and its relationship with prognosis in laryngeal squamous cell carcinoma ( SCC ) and adjacent normal mucosa of laryngeal squamous cell carcinoma ( SCC ) . The expression of miR - 497 was significantly lower than that in control group ( P0.05 ) . The expression of miR - 497 was significantly lower than that of control group ( P0.05 ) . Conclusion : 1 . The expression of miR - 497 in laryngeal squamous cell carcinoma is significantly higher than that in the control group .

【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.65

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本文编号：1449566