醒鼻凝胶滴鼻剂干预变应性鼻炎及对Fyn-STAT5信号通路影响的研究

发布时间：2018-01-27 13:29

  本文关键词： 变应性鼻炎 中药干预 醒鼻凝胶剂 成纤维细胞 Fyn-STAT5信号通路 NF-κB基因敲除 TGF-β1　出处：《福建中医药大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的本课题以变应性鼻炎(allergicrhinitis,AR)豚鼠及体外分离的大鼠鼻黏膜成纤维细胞为研究对象,采取体内和体外相结合的研究方法,研究分析Fyn-STAT5信号通路在AR发病中的作用,并应用醒鼻凝胶滴鼻剂进行干预,以阐明醒鼻凝胶滴鼻剂干预变应性鼻炎的作用机制,为提高变应性鼻炎的临床疗效奠定实验基础。方法1.醒鼻凝胶滴鼻剂干预AR豚鼠模型及对Fyn-STAT5信号通路影响的实验研究选取健康3月龄清洁级豚鼠60只,雌雄各半,随机分为空白对照组(A组,15只)和模型组(45只)。模型组采用卵清蛋白(OVA)和Al(OH)3混和液腹腔注射的方法建立AR模型,造模成功后依体重、性别按分层随机法分为AR模型组(B组)、醒鼻凝胶滴鼻剂治疗组(C组)和雷诺考特鼻喷雾剂对照组(D组)。给药从腹腔注射后第2天开始,A、B两组用生理盐水滴鼻,C组用醒鼻凝胶滴鼻剂原液50μl滴鼻,D组用布地奈德鼻喷雾剂原液50μl滴鼻,每天3次,连续11天。激发时A组用生理盐水50μl滴鼻,B、C、D组用2%OVA溶液滴鼻。激发从腹腔注射后第4天开始,隔日1次,共5次。给药结束后将豚鼠致死取主动脉血,采用ELISA方法检测血清IL-10、MMP10水平。取豚鼠鼻粘膜,用HE染色法观察鼻黏膜形态,免疫组化方法检测鼻黏膜CD19、CD23蛋白水平的表达,real-time PCR方法检测MCP-1、MMP-10、TGF-β1mRNA水平的表达,Western blot方法检测Fyn、STAT5的蛋白水平表达。2.醒鼻凝胶滴鼻剂干预AR大鼠模型对鼻黏膜成纤维细胞Fyn-STAT5信号通路影响的实验研究选取健康清洁级大鼠10只,鼠龄2个月,雌雄各半,体重150g-250g,按分层随机法分为正常组(5只)和模型组(5只);NF-κB基因敲除大鼠5只,雌性3只,雄性2只,40日龄,体重130g-200g。模型组大鼠和NF-κB基因敲除AR大鼠的模型建立方法同体内实验。大鼠处死后分离两侧鼻黏膜,分离成纤维细胞,采用差速贴壁法纯化细胞,然后从形态学角度观察成纤维细胞形态,用细胞免疫化学方法检测成波形蛋白相关抗原。将成纤维细胞分为正常大鼠鼻黏膜成纤维细胞组(A组)、AR大鼠鼻黏膜成纤维细胞组(B组)、NF-κB基因敲除AR大鼠成纤维细胞组(C组);NF-κB基因敲除+TGF-β1组(D组)、NF-κB基因敲除+醒鼻凝胶滴鼻剂组(E组)和NF-1κB基因敲除+布地奈德鼻喷雾剂组(F组)。各组细胞分别干预12小时、24小时和48小时,干预结束后收集细胞并提取蛋白,用Western blot法检测各组Fyn、STAT5的蛋白表达水平。结果1.AR豚鼠模型成功率为86.67%,45只实验豚鼠脱落6只,其中2只死亡,3只因评分5分被剔除。2.AR豚鼠鼻黏膜HE染色可见嗜酸性细胞浸润,醒鼻凝胶滴鼻剂和布地奈德鼻喷雾剂干预后均能显著改善鼻黏膜嗜酸性细胞的浸润(P均0.05),并能抑制CD19和CD23的表达(P均0.05),醒鼻凝胶滴鼻剂组和布地奈德鼻喷雾剂组比较则无显著差异(P0.05)。3.醒鼻凝胶滴鼻剂和布地奈德鼻喷雾剂干预AR豚鼠均能降低血清IL-10、MMP10、TGF-β1、MCP-1和MMP10mRNA水平(P均0.05),并能抑制Fyn表达、上调STAT5表达(P均0.05),醒鼻凝胶滴鼻剂组和布地奈德鼻喷雾剂组比较则无显著差异(P0.05)。4.经NF-κB基因敲除后的AR大鼠鼻黏膜成纤维细胞Fyn表达受到明显抑制,STAT5表达明显上调。(P均0.05)5.经TGF-β1干预的AR大鼠鼻黏膜成纤维细胞Fyn表达受到明显抑制,STAT5表达明显上调。(P均0.05)6.醒鼻凝胶滴鼻剂组和布地奈德鼻喷雾剂组均能明显抑制体外AR大鼠鼻黏膜成纤维细胞Fyn-STAT5的信号通路(P均0.05),而二组之间比较无显著差异(P0.05)。结论1.醒鼻凝胶滴鼻剂通过降低炎性介质、细胞因子的产生,以及抑制IgE受体的合成,起到抑制肥大细胞活化和脱颗粒的发生,达到治疗AR的作用。2.醒鼻凝胶滴鼻剂通过抑制Fyn-STAT5信号通路的方式,抑制肥大细胞活性,减轻变态反应的发生,达到治疗AR的作用。3.NF-κ B和TGF-β 1通过介导Fyn-STAT5信号通路的方式参与鼻黏膜成纤维细胞的活化,并且对该信号通路有抑制作用。4.醒鼻凝胶滴鼻剂对体外鼻黏膜成纤维细胞有抑制作用,这种抑制作用是通过调节Fyn-STAT5信号通路的方式发挥效,从而抑制鼻黏膜成纤维细胞的活化,抑制AR的发生。
[Abstract]:The purpose of this subject to allergic rhinitis (allergicrhinitis, AR) in rat nasal mucosa of guinea pigs and in vitro fibroblast cells as the research object, adopting the research method of combining in vitro and in vivo, analysis on the role of Fyn-STAT5 signaling pathway in the pathogenesis of AR, and the application of intervention of Xingbi nasal gel nasal drops, to clarify the role of the mechanism of Xingbi nasal gel nasal drops intervention of allergic rhinitis, to improve the clinical efficacy of allergic rhinitis to lay an experimental basis. 3 month old healthy clean grade 60 guinea pigs, 1. experimental methods of Xingbi nasal gel nasal drops intervention AR guinea pig model and its effects on Fyn-STAT5 signal pathway selection of male and female, were randomly divided into blank control group (group A, 15 rats) and model group (45 rats). The model group using ovalbumin (OVA) and Al (OH) 3 mixed solution intraperitoneal injection method to establish the AR model, after the success of the model according to the weight, sex randomly divided into AR 妯″瀷缁，

本文编号：1468580