SHH基因沉默对视网膜母细胞瘤细胞增殖凋亡的影响及机制

发布时间：2018-01-29 04:55

本文关键词： 视网膜母细胞瘤 SHH基因细胞增殖细胞凋亡 PI3K/Akt信号通路　出处：《吉林大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：视神经母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)是婴幼儿中较为常见的一种起源于视网膜胚胎性的眼内恶性肿瘤,发病率约为1:15000,近年来仍有逐渐上升的趋势。RB多发于婴幼儿,若不给予及时治疗,RB易在眼球内迅速生长和扩散,最终导致视网膜分离和坏死,并沿视神经向颅内蔓延,严重危害患儿的视力和生命。目前RB的主要治疗方法有光凝、手术、冷冻以及放化疗等,但这些方法均存在诸多副作用。深入探讨RB的病理机制,寻求更好、更有效的治疗方案对RB的临床防治具有重要意义。SHH基因是Hedgehog(HH)的三个同源基因之一,在胚胎发育形成、细胞生长分化过程中具有重要调控功能。既往研究表明在髓母细胞瘤、基底细胞癌、结直肠癌、肺癌中均存在HH的异常表达,SHH被认为是肿瘤恶性程度高的标志物之一。HH通路的异常活化直接参与肿瘤的发生发展过程,靶向调控肿瘤细胞周期及侵袭相关蛋白因子Cyclin D、Cyclin E、N-Myc等的表达,进而影响细胞周期、分化及凋亡等生理过程。研究显示RB临床组织样本中SHH基因显著高表达,且SHH基因表达水平与RB肿瘤分期、局部浸润和转移密切相关。但SHH在RB中的具体调控机制尚不清楚,SHH对RB细胞生物学功能的影响有待进一步深入研究。PI3K/Akt信号通路在多种肿瘤中持续性激活,研究表明该通路的激活能够诱导细胞周期相关基因转录,破坏促凋亡(Bax、Bad)和抗凋亡(Bcl-2)蛋白表达的平衡,抑制肿瘤细胞凋亡、促进细胞增殖。此外,在胰腺癌中的研究显示,HH信号通路失活后通过抑制PI3K/Akt信号通路减少细胞增殖、诱导细胞凋亡。在胶质母细胞瘤中外源性加入SHH能提高Hedgehog信号通路的活性,增加p-Akt的表达,阻断Hedgehog通路后p-Akt表达显著下降;PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002能够减少SHH诱导的MMP2、MMP9的异常表达,降低细胞的侵袭和迁移能力,表明HH信号通路可以通过调控PI3K/Akt信号通路活性介导肿瘤细胞的增殖和生长。但视网膜母细胞瘤中HH是否通过PI3K/Akt信号通路影响肿瘤细胞的生物学活性尚不清楚。本研究通过RNA干扰技术沉默视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞中SHH的表达,观察SHH基因沉默对RB细胞增殖凋亡的影响,并深入探讨SHH对PI3K/Akt信号通路的调控作用,明确SHH基因在RB发生进展中的作用和分子机制,旨在为以SHH为靶点的RB分子靶向治疗提供理论依据。1.RNA干扰SHH基因真核表达载体的构建和筛选目的:构建特异性针对SHH基因的RNA干扰质粒SHH-sh RNA,并验证该重组质粒对RB细胞WERI-Rb-1中SHH在m RNA水平和蛋白水平的抑制效果,为研究SHH对WERI-Rb-1细胞生物学功能的影响提供理论基础。方法:设计3条针对SHH的干扰序列及1条阴性对照序列,酶切后与sh RNA表达质粒p RNAH1.1连接,构建针对SHH的RNA干扰重组质粒及其阴性对照质粒。将SHH-sh RNA重组质粒及阴性对照质粒转染WERI-Rb-1细胞,并通过G418筛选稳转细胞。Real-time PCR检测细胞中SHH m RNA表达水平,筛选沉默效果最佳的干扰序列,Western blot检测各组细胞中SHH蛋白表达水平,在蛋白水平上验证SHH-sh RNA的抑制效果。结果:成功构建了针对SHH的特异性RNA干扰质粒SHH-sh RNA-1、SHH-sh RNA-2、SHH-sh RNA-3及阴性对照NC,转染WERI-Rb-1后G418筛选得到稳转细胞,Real-time PCR检测结果显示,与对照组相比,SHH-sh RNA转染后细胞中SHH m RNA表达水平均下降,且差异具有统计学意义(P0.01)。与SHH-sh RNA-2(35%)、SHH-sh RNA-3(68%)组相比,SHH-sh RNA-1的沉默效果最佳,干扰效率达到82%。因此选择SHH-sh RNA-1转染的WERI-Rb-1细胞进行后续实验,Western blot检测WERI-Rb-1组、NC组和SHH-sh RNA组细胞中SHH蛋白表达水平,结果显示SHH-sh RNA组细胞中SHH蛋白表达水平显著下降,干扰效率达到75%,差异具有统计学意义(P0.01)。结论:成功构建特异性针对SHH基因的RNA干扰质粒SHH-sh RNA,转染WERI-Rb-1细胞后能有效抑制SHH在m RNA和蛋白水平的表达,为SHH在WERI-Rb-1细胞增殖和凋亡中的作用研究提供了基础。2.SHH基因干扰对视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响目的:明确SHH基因沉默对视网膜母细胞瘤WERI-Rb-1细胞增殖和凋亡的影响。方法:实验设置WERI-Rb-1组、NC组和SHH-sh RNA组,通过MTT实验检测SHH基因沉默对WERI-Rb-1细胞增殖的影响;流式细胞术检测各组细胞周期的变化,克隆形成实验检测各组细胞体外成瘤能力;流式细胞术Annexin V/PI双染和Hoechst染色检测SHH沉默对细胞凋亡的影响;Western blot检测SHH基因沉默后细胞中凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP、Bcl-2、Bax的表达。结果:MTT检测结果显示SHH-sh RNA组与对照组相比,细胞增殖能力显著下降(P0.01);流式细胞术检测细胞周期结果显示SHH基因沉默后G0/G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例下降,且差异具有统计学意义(P0.01),细胞克隆形成实验结果显示SHH-sh RNA组细胞克隆形成数显著减少(P0.01);流式细胞术Annexin V/PI双染和Hoechst染色结果均表明SHH-sh RNA组细胞凋亡率增加(P0.01)。Western blot检测结果显示SHH-sh RNA组细胞中Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP、Bax蛋白表达水平显著增加,Bcl-2含量下降(P0.05)。结论:SHH基因沉默能抑制WERI-Rb-1细胞增殖,使细胞周期停滞于G0/G1期,并通过下调Bcl-2/Bax的比例,上调Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP的表达促进细胞凋亡。3.SHH基因干扰影响视网膜母细胞瘤细胞增殖凋亡的分子机制目的:明确SHH基因沉默对WERI-Rb-1细胞中PI3K/Akt信号通路的调控作用以及SHH基因是否通过PI3K/Akt通路影响WERI-Rb-1细胞增殖和凋亡。方法:Western blot检测WERI-Rb-1组、NC组和SHH-sh RNA组中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt的表达,验证SHH基因沉默对PI3K/Akt通路具有调控作用后,采用PI3K/Akt通路激活剂进行干预,实验设置NC组、SHH-sh RNA组、NC+IGF-1组和SHH-sh RNA+IGF-1组,Western blot检测p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt的表达,验证IGF-1可以激活PI3K/Akt通路,MTT检测IGF-1处理对SHH基因沉默的WERI-Rb-1细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP、Bcl-2、Bax的表达。结果:Western blot检测结果显示SHH基因沉默的WERI-Rb-1细胞中p-PI3K和p-Akt表达显著降低,使用IGF-1处理后p-PI3K和p-Akt表达增加。MTT及流式细胞术检测结果显示与SHH-sh RNA组相比,SHH-sh RNA+IGF-1组细胞增殖能力显著增加,细胞凋亡率下降,且差异具有统计学意义(P0.01)。Western blot检测结果显示SHH-sh RNA+IGF-1组细胞中Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP、Bax表达下降(P0.01),Bcl-2表达水平增加(P0.05)。结论:SHH基因沉默抑制WERI-Rb-1细胞中PI3K/Akt通路的激活。SHH基因可能通过激活PI3K/Akt信号通路,上调细胞中Bcl-2/Bax的比例,抑制Cleaved caspase-3、Cleaved-PARP的表达促进WERI-Rb-1细胞增殖,抑制凋亡。
[Abstract]:This study shows that the expression of SHH gene is one of three homologous genes of Hedgehog ( HH ) . The expression of SHH - sh RNA - 1 , SHH - sh RNA - 1 , SHH - sh RNA - 3 and negative control plasmid were studied . The results showed that SHH - sh RNA - 1 , SHH - sh RNA - 1 , SHH - sh RNA - 3 and negative control plasmid were constructed . The effects of SHH gene silencing on the proliferation and apoptosis of the cells were studied by MTT assay . The results showed that SHH gene silencing inhibited the proliferation of caspase - 3 , C - 2 / Bax in SHH - sh RNA + IGF - 1 cells . The results showed that SHH - sh RNA + IGF - 1 had a significant decrease in the expression of caspase - 3 , C - 2 / Bax , and the expression of Bcl - 2 / Bax was detected by Western blot . Results : Western blot showed that SHH - sh RNA + IGF - 1 had a significant decrease in the expression of Bcl - 2 / Bax .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.7

【参考文献】