Rho激酶抑制剂对兔外伤性视神经损伤保护作用的实验研究

发布时间：2018-02-12 22:24

本文关键词： 外伤性视神经病变 Rho激酶抑制剂 Rho/ROCK信号通路　出处：《新疆医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:外伤性视神经损伤是颅脑、面部和眼眶外伤的严重并发症,损伤后视力减弱或视野出现缺失,严重的甚至出现永久性视力障碍。然而视神经损伤后干预治疗的基础层面研究,却存在争议。视神经损伤后可能存在某种因素抑制神经轴突的修复和再生。最新研究表明,中枢神经受损后,存在有Rho/ROCK信号通路主导的抑制轴突修复和再生的抑制性环境。本研究旨在通过构建兔外伤性视神经钳夹损伤模型,采取随机对照实验,分析Rho激酶及其下游分子的表达情况。同时应用Rho激酶抑制剂法舒地尔,抑制Rho/ROCK信号通路,研究Rho激酶抑制剂对受伤视神经轴突的保护和促进其轴突功能恢复的作用。通过常规病理、电镜等方法考察视神经损伤用药后视网膜神经节细胞凋亡、瞳孔变化,从而研究视神经微血管及超微结构病理变化及溃变过程,了解Rho激酶抑制剂干预措施对视神经损伤后微血管的病理改变。此外,考察视神经损伤用药后Rho激酶及其下游分子表达水平的变化,确定诱导RGCs继发性变性的初始因子,阐明其发生凋亡的机制。最终评估Rho激酶抑制剂对兔外伤性视神经损伤后视网膜、视神经组织形态学的影响及轴突修复和再生微环境的影响,探讨其对视神经损伤的保护机制。方法:成年健康新西兰白兔150只,按随机数字表法,随机选取6只未建模兔子为正常对照组(未损伤视神经);其余144只建立兔外伤性右侧视神经钳夹损伤模型,根据药物干预的不同将建模成功的144只新西兰兔随机分为3组,每组48只,分别为Rho激酶抑制剂组、地塞米松组及生理盐水组。分别在损伤后3、7、14、21天摘取眼球制作石蜡切片和超微切片,石蜡切片进行苏木素-伊红染色、TUNEL染色,超微切片通过柠檬酸铅和醋酸双氧铀染色后进行电镜观察,分析比较损伤后视网膜和视神经形态学变化;通过对石蜡切片进行免疫组化染色,检测Caspase-3、Bcl-2、Crmp-2、Rho-A、ROCK1、ROCK2、Nogo-A的阳性表达水平;每个时间点每种分析各取3~6只兔子样本,分离视神经和视网膜,通过RT-PCR检测RhoA、ROCK1、ROCK2、MLC、NOGO-A及GAP-43基因mRNA的相对表达量,比较模型建立后Rho激酶与下游分子的表达情况。此外,通过Western-Blot检测GAP-43、Nogo-A、p-MLC、MLC及Caspase-3蛋白表达量,进一步验证Rho/ROCK信号通路各因子的表达水平。结果:(1)组织形态学光镜观察:采用HE染色法,视神经损伤后光镜下观察,早期视网膜出现肿胀,各层厚度较正常略增厚,细胞排列疏松而紊乱,仅见视网膜毛细血管扩张,视网膜神经节细胞少量减少。视网膜HE染色组织形态学观察,正常组视网膜形态正常,结构完整,分层整齐,层次清晰,RGCs呈单层排列,整齐密集,胞核清楚,核膜光滑完整。但是随时间推移,各损伤时间节点损伤病理改变明显,呈进行性加重。视神经损伤3天组,视网膜形态改变,分层稍紊乱,细胞轻度水肿,层厚稍变厚,节细胞减少,视网膜内核层细胞数目稍有减少,内核层出现水肿。视神经损伤7天组,视网膜分层结构紊乱,视网膜神经节细胞核深染,细胞间隙增大,大量节细胞空泡变性,数目减少,有少量核固缩,染色加深,内核层和外核层细胞明显减少。视神经损伤14天组视网膜形态改变,较前一组加重,视网膜结构分层紊乱,视网膜神经节细胞固缩,大量减少,内核层、外核层细胞大量缺失,外核层、外网层受到一定程度的破坏。视神经损伤21天组,视网膜结构分层紊乱,水肿改变较之前有所减轻,视网膜神经节细胞明显固缩,大量减少,核深染,各层结构紊乱,视网膜全层变薄。(2)视神经超微结构的电镜观察:正常组视神经主要由视网膜神经节细胞的轴突及周围髓鞘、间质内的视神经胶质细胞组成,大量轴突排列整齐,横切面类圆形,包绕髓鞘。髓鞘致密,呈细板层样结构,呈致密板层排列,轴突内布满微管、微丝,并可见线粒体等细胞器。视神经损伤3天组视神经轴突肿胀明显,轴突数目减少,部分轴突髓样变性,轴突内微管微丝扭曲、排列稀疏。线粒体肿胀,嵴变短,消失,线粒体空泡样变,髓鞘厚度变薄,板层结构分离;视神经损伤7天组,髓鞘松解,髓鞘普遍变性,洋葱样小体形成,厚度增加,板层结构分离成多层,个别表现为脱髓鞘。胶质细胞增生明显,仍残留有水肿软化小区,胶质细胞肿胀,线粒体空泡变,部分神经轴浆空泡变;视神经损伤14天组,视神经轴突空泡样结构多见,微管微丝溶解消失。板层结构分离,神经间质基质密度降低;视神经损伤21天组,神经变性,神经纤维结构不规则,髓鞘结构明显紊乱,可见鞘膜泡状解离,髓鞘明显减少,微丝溶解,部分纤维轴浆空泡变,水肿软化灶消失,轴突内有大量杂质填充(胶质细胞胞突多见),可见小簇状分布小髓鞘,旁边可见些肿胀的髓鞘。地塞米松组与盐水组比较,线粒体肿胀较轻,而法舒地尔组板层分离较少,视神经损伤修复稍好,轴突枝芽较对照组多一些。(3)免疫组化观察:外伤性视神经损伤后,视网膜和视神经表达的Rho A和ROCK蛋白水平明显增强,而用Rho激酶抑制剂法舒地尔处理能够显著降低视网膜及视神经Rho A和ROCK蛋白的表达。地塞米松组和Rho激酶抑制剂法舒地尔组均能够明显降低视神经损伤后Rho/ROCK信号通路下游分子Crmp2在视神经的表达,而且法舒地尔处理后降低效果更加明显。视神经损伤后,免疫组化结果显示凋亡相关蛋白Caspase3表达逐渐升高,抗凋亡蛋白Bcl2表达逐渐降低。(4)分子生物实验(RT-PCR及Western-Blot)检测:盐水组的视网膜ROCK2基因相对表达量在14天时升高;RHO激酶抑制剂组的视网膜ROCK2基因相对表达量在14天时与3天组、7天组、21天组都有统计学差异(P0.05),RHO抑制剂组的视网膜ROCK2基因相对表达量在14天时低于盐水组和地塞米松组;其它因子的检测结果相类似。RT-PCR实验结果显示视神经损伤后Nogo-A的相对表达量随着时间的增加表达量上升,第14天达到峰值。而GAP-43的相对表达量与造模时间同样呈正相关,峰值出现在第7天。Western Blot结果表明在蛋白水平表达趋势类似。结论:本研究利用临时动脉瘤夹钳夹新西兰兔视神经建模,成功构建了视神经损伤动物模型,其表现与临床外伤性视神经病变进程较类似。视神经损伤后视网膜、视神经的形态学明显改变,凋亡率显著增加。视神经损伤后,Rho/Rock信号通路被激活,视网膜神经节细胞中Rho A、ROCK1、ROCK2分子表达上调,提示此信号通路在视神经损伤后发挥重要功能。Rho激酶抑制剂法舒地尔在外伤性视神经病变模型中,通过抑制Rho A激酶及其下游分子的表达,从而抑制Rho/ROCK信号通路,对外伤性视神经病变有较为明显的保护作用,其效果可能要好于地塞米松。另外RT-PCR及Western-Blot分析结果表明Nogo-A、GAP-43基因共同参与视神经损伤后轴突的修复与再生进程。Rho激酶抑制剂可抑制Nogo-A基因的表达,促进GAP-43表达水平上调。本研究结果为以Rho-Rock信号通路为靶点治疗视神经损伤的分子生物学机制研究及药物研发提供了理论依据。
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【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.6

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