非综合征型耳聋高通量检测技术及致病突变研究
本文关键词: 耳聋 非综合征型耳聋 基因检测 飞行时间质谱 靶向基因捕获测序 出处:《北京协和医学院》2017年博士论文 论文类型:学位论文
【摘要】:耳聋是最常见的出生缺陷性疾病之一,约60%的耳聋与遗传因素有关。遗传性耳聋具有高度的遗传异质性和广泛的种族差异,我国耳聋分子流行病学调查数据显示,GJB2基因、SLC26A4基因和线粒体基因12SrRNA是我国耳聋人群主要致病基因,这为在我国开展耳聋基因诊断奠定了基础。为了满足我国临床对耳聋基因诊断的需求,本论文建立了一个从常见耳聋基因突变高通量检测到罕见耳聋基因突变高效鉴定的耳聋基因诊断体系。本论文利用自动移液工作站和飞行时间质谱技术建立了一套包括自动化样本制备和高通量耳聋基因检测的中国人常见耳聋基因高通量检测技术体系,并使用临床样本对该检测体系的准确性及有效性进行了评价;采用靶向基因捕获和高通量测序技术建立了一套可高效鉴定非综合征型耳聋患者的新致病突变的体系。上述两个检测体系组成了一个完整的非综合征型耳聋基因检测的解决方案,对提高我国耳聋基因诊断的水平具有较大意义。本论文根据中国耳聋分子流行病学调查数据,选择了中国人群常见的3个耳聋致病基因(GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA)共30个突变位点,建立了基于飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术的单一反应检测这30个突变位点的高通量检测方法,利用该方法检测了 327例临床明确基因诊断的非综合征型耳聋样本,30个突变均得到检出,而且本论文检测方法的结果与临床基因诊断结果一致,符合率100%;进一步使用该方法检测了 373例非综合征型耳聋患者样本,发现210例患者携带至少一个突变(56.30%,210/373),确诊患者155例(41.55%,155/373),其中GJB2基因致聋者63例(16.89%,30/373),SLC26A4基因致聋者88例(23.59%,88/373),线粒体基因12SrRNA致聋者4例(1.07%,4/373),并使用基因检测的金标准Sanger测序法对分型结果进行了验证,两种方法结果一致,符合率100%;我们也基于自动移液工作站建立了血斑样本DNA自动化制备方法,应用该方法和4种磁珠法DNA提取试剂盒提取了 64个新生儿血斑样本DNA,DNA平均浓度在10.76 ng/μl至21.88 ng/μl之间,平均纯度260/280在1.84至1.99之间,使用飞行时间质谱方法检测这64个样本,发现了 5个耳聋基因突变携带者。我们选取了 92例已使用本研究建立的质谱检测方法未能确诊的非综合征型耳聋样本,这92例耳聋样本包括了 90个先证者样本及2个受累同胞样本,应用包括200个耳聋相关基因的靶向基因捕获测序技术检测了这92例非综合征耳聋样本,对鉴定到的突变进行了生物信息学分析,并使用直接测序法对鉴定出的突变进行了验证。结果显示,有20个先证者可以确诊,诊断率为22.2%,这20个确诊的先证者的38个致病突变分布在15个耳聋基因上,其中23个是新致病突变。本论文基于自动移液工作站和飞行时间质谱建立的中国人常见耳聋基因高通量检测技术体系,具有高通量、高准确性、低成本等特点,可以对耳聋患者进行准确快速诊断,为规模化耳聋防控提供了有力的技术支撑。本论文建立的包含200个耳聋基因的靶向基因捕获测序方法明确了 22.2%的先证者的分子病因,大幅提高了临床确诊率。鉴定了 23个新致病突变,丰富了中国人耳聋基因突变数据库,为非综合征型耳聋分子病因学研究提供了理论支持。
[Abstract]:Deafness is the most common disease of birth defects, about 60% of the deafness associated with genetic factors. Genetic deafness has high genetic heterogeneity and widespread racial differences in GJB2 gene molecular epidemiological survey data deafness in our country shows that, SLC26A4 gene and mitochondrial gene 12SrRNA in China is the main pathogenic gene for deaf people, which lay the foundation for genetic diagnosis of deafness in China. In order to meet China's demand for clinical genetic diagnosis of deafness, this paper established a mutation from common deafness genes in high-throughput detection to the efficient identification of rare mutations in deafness deafness gene diagnosis system. This paper uses automatic pipetting workstation and time-of-flight mass spectrometry was established common deafness genes in a high-throughput detection automatic sample preparation and high-throughput deafness gene Chinese system detection technology, and the use of clinical samples And the effectiveness of the detection accuracy of the system is evaluated; to capture gene and high-throughput sequencing technology to establish a set of efficient identification of new pathogenic non syndromic deafness mutations in patients with the system target. The two detection system composed of a complete solution of non syndromic deafness gene detection that is of great significance to improve our level of gene diagnosis of deafness. According to the Chinese deafness molecular epidemiological survey data, selected 3 common deafness gene Chinese populations (GJB2, SLC26A4, mitochondrial 12SrRNA) a total of 30 mutations, a time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) detection method based on the 30 mutations in high-throughput detection of single reaction, was detected in 327 cases of clinical definite genetic diagnosis of non syndromic deafness samples by using this method, 30 mutations were detected, and And this paper detection methods and results of clinical gene diagnosis results, the coincidence rate was 100%; the further use of this method to detect 373 cases of non syndromic deafness type samples of patients, 210 patients with at least one mutation (56.30%, 210/373), 155 patients (41.55%, 155/373), including 63 cases of GJB2 gene deaf person (16.89%, 30/373), 88 cases of SLC26A4 gene induced by the deaf (23.59%, 88/373), 4 cases of mitochondrial gene 12SrRNA induced hearing loss (1.07%, 4/373), the gold standard Sanger sequencing method, and gene detection results are verified, the results of the two methods are consistent, the coincidence rate was 100%; we also set up automatic pipetting workstation based on DNA automatic blood spot sample preparation method, the application of this method and 4 kinds of magnetic beads method DNA extraction kit to extract 64 newborn blood spot samples DNA, DNA average concentration between 10.76 ng/ L and 21.88 ng/ L, the average purity of 260/280 Between 1.84 and 1.99, using time-of-flight mass spectrometry method for the detection of the 64 samples, found 5 deafness gene mutation carriers. We selected 92 cases of mass spectrometry has been used in this study failed to establish diagnosis of non syndromic deafness in 92 cases of samples, the sample included 90 probands and sample 2 affected sib sample applications include 200 deafness related gene targeting gene sequencing technique to detect the capture of 92 cases of non syndromic deafness mutations of samples, identified to analyze the bioinformatics, and the mutations identified were verified by direct sequencing. The results showed that there are 20 first card can be diagnosed, the diagnostic rate was 22.2%. 38 of the 20 pathogenic mutations in the proband diagnosed in 15 deafness genes, 23 of which are new mutations. This thesis is based on the automatic pipetting workstation and time-of-flight mass spectrometry Common deafness genes developed high-throughput Chinese detection technology system, with high throughput, high accuracy, low cost, can be rapid and accurate diagnosis of patients with deafness, which provides strong technical support for large-scale deafness prevention. Established in this dissertation contains 200 deafness gene targeting gene sequencing method to capture clear the molecular etiology of 22.2% probands, a substantial increase in the rate of clinical diagnosis. 23 new pathogenic mutations were identified, enriched the gene Chinese deafness mutation database, provides theoretical support for non syndromic deafness molecular etiology of type.
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R764.43
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,本文编号:1531010
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