BER通路功能性SNP与鼻咽癌易感性的关联分析及其生物学功能研究

发布时间：2018-03-02 14:19

本文选题：鼻咽癌　切入点：单核苷酸多态性　出处：《广西医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分单碱基切除修复通路中关键基因功能性SNP位点筛选及其与鼻咽癌的关联分析一.研究背景和目的：鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是中国南方尤其是广东、广西地区常见的头颈部恶性肿瘤。目前有研究认为内外源性化合物产生的活性氧(reactive oxygenic species, ROS)导致的DNA损伤参与了NPC的发生、发展机制。因此氧化损伤修复对于维持细胞基因组稳定,防止细胞癌变至关重要。DNA损伤修复的通路有多条,其中碱基切除修复(base excision repairBER)是主要途径。BER相关基因及其编码的蛋白功能下降将会使DNA损伤的修复功能受损,从而增加细胞癌变的风险。已有研究表明,单碱基修复的BER途径中多个关键基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)能够影响DNA的修复功能。对于该通路相关基因SNP与NPC易感性的相关研究目前报道不多,且部分研究的结果并不一致。因此本研究利用生物信息学的方法和以往文献筛选BER相关基因中具有潜在功能的SNP,并通过病例对照分析的方法,纳入来源于广西医科大学附属医院的NPC患者及健康对照,通过对比二者之间分布频率进行验证,以找到该通路相关基因中NPC风险相关性SNP。二.材料与方法：(一).利用生物信息学技术对BER中关键基因进行筛选。1.BER通路中候选基因的确定：根据以往的文献确定BER通路中关键基因作为后续SNP检测的候选基因。2.候选基因SNP的数据下载：从International Hap Map Project数据库下载。 3.标签SNP(tag SNP)勺确定：采用Haploview4.2软件对已下载的各候选基因SNP数据进行分析,确定每个候选基因中符合标准的tagSNP。4.在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中将每个候选基因包括的全部SNP位点,在EXON及5'UTR.3'UTR区中的SNP位点进行核实,将未曾在TagSNP出现的这三个区域位点进行替换。5.在http://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.htm网站中将上述筛选得到的tagSNP位点进行潜在功能性预测。6.综合考虑SNP位点所在的功能区、功能预测结果、PHWE、MAF以及已发表的文献研究结果,筛选出符合条件的候选SNP作后续研究。(二).BER通路相关基因候选SNP位点的初步筛选：共纳入研究对象共459例,其中鼻咽癌患者204例,对照组患者255例。抽取外周静脉血,提取DNA。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of fly mass spectrum,MALDI-TOF-MS)对样本进行BER通路相关基因候选SNP分型测定。(三).BER通路中入选基因SNP位点的验证：1.在初步筛选的基础上进一步扩大NPC患者及健康无癌对照的例数,总共纳入488例NPC患者和与573例未患癌的正常人进行研究。2.抽取新加入NPC患者或正常健康对照3m1外周血,进行DNA提取。3.采用TaqMan探针实时荧光PCR法进行hOGG1 rs1052133和hMUTYHrs3219472 SNP基因型分型。三.结果：(一).通过本研究筛选标准和策略,共选择出BER通路中19个关键基因,共38个tagSNP进行后续的验证。(二).共纳入204例NPC患者及255例健康对照进行SNP初步筛选。MALDI-TOF-MS共检测出34个具有潜在功能的SNP,其野生型等位基因频率与突变型等位基因频率差别均无统计学意义(P值均大于0.05)。我们挑选P值最小的2个SNP,即hOGGl rs1052133 (P=0.054)、hMUTYH rs3219472(P=0.075)作为后续的验证。(三)hOGG1 rs 1052133和hMUTYH rs3219472 SNP与NPC易感性关系的进一步验证：1.共纳入488例NPC患者和573例正常对照者进行hOGG1 rs1052133和MUTY rs3219472 SNP分型。2.hOGGl rs1052133 SNP与NPC发病风险相关性：利用recessive model检测发现,NPC患者组中hOGG1 rs10 52133GG基因型频率显著低于健康对照组(30.9%vs 36.8%),相对于GC或CC基因型,GG患NPC的风险降低,OR=0.769(95%CI 0.595～0.993)。 OR=0.770 (95%CI 0.595～0.996)。在年龄大于40岁的研究对象中,GG基因型携带者发生NPC的风险是GC或CC基因型的0.706倍(OR=0.706,95%C10.524-0.950),校正OR值=0.707(95%C10.524-0.953)。在女性中,GG基因型发生NPC的风险是CC或GC者的0.571倍(OR=0.571,95%CI0.337-0.968),校正OR=0.574(95%C10.338-0.975)。在非吸烟者中,携带GG基因型者患NPC的风险是CC或GC者的0.635倍(OR=0.635,95%CI0.464-0.866),校正OR=0.634(95% CI 0.463～0.868)。hMUTYH rs3219472 SNP,即AA型或GA+GG基因型频率在NPC患者组和健康对照组中均无显著差别。3.hOGG1 rs 1052133和 hMUTYH rs3219472 SNP对NPC患病风险的联合作用：同时携带hOGGl rs 1052133 CC基因型和hMUTYH rs3219472 AA基因型者(CC/AA)患NPC的风险显著高于GG/GG、GG/GA、 GG/AA,OR值分别为2.887、3.183、3.392。四.结论：1.BER通路相关基因中,hOGGl rs 1052133 SNP可能与NPC风险密切相关。其中GG基因型可能是降低NPC发病风险的保护性因子,特别是对于女性、年龄大于40岁、非吸烟人群。2.hOGG1 rs1052133 SNP可与 hMUTYH rs 3219472 SNP相互作用而影响NPC的易感性。第二部分hOGGl rs 1052133多态性与NPC临床相关研究一.研究背景和目的：NPC是中国南方常见的恶性肿瘤,每年的发病率为20-30/100,000。目前NPC的发生、发展的机制仍不十分清楚。本研究第一部分结果显示,携带hOGG1rs1052133 GG基因型SNP者患NPC的风险可能较其他基因型低,提示该SNP可能与NPC的发生密切相关。但其具体机制如何,目前鲜有相关报道。有研究表明,rs1052133C C型SNP与某些恶性肿瘤临床特性和预后有关。作为中国南方地区主要的头颈部恶性肿瘤,NPC的临床特征及预后与该SNP是否有关值得研究。因此,本研究收集NPC患者的临床样本(包括肿瘤组织、血清)及临床资料进行分析,评估NPC患者体内hOGG1基因、其编码蛋白的功能状态、rs1052133 SNP与患者临床参数及预后的相关性,以期进一步阐明该SNP在NPC发生发展中的机制。二.方法1.研究对象：(1)为进行免疫荧光染色检测,我们收集了2013年1月至2014年6月在广西医科大学第一附属医院及附属肿瘤医院就诊,由病理确诊为NPC的初诊患者40例,经活检病理证实鼻咽部粘膜慢性炎而排除NPC的健康人15例。研究对象在进行鼻咽部组织活检时,留取部分组织样本用于免疫荧光染色；(2)纳入在广西医科大学一附院和附属肿瘤医院初诊的99例NPC患者,抽取其外周静脉血并制备血清,用ELISA法检测血清中8-OHdG含量。(3)hOGG1rs1052133 SNP与NPC预后相关性研究：在本研究第一部分接受了hOGGl rs1052133SNP分型的488例NPC患者均作为预后分析的候选对象。收集并分析这些患者的临床资料,按入选标准筛选出符合条件患者进行预后分析。2.操作步骤：(1)免疫荧光染色结果均由两位实验者独立观察判断,取平均值进行汇总。镜下直接计数并同时采用激光共聚焦图象数据分析软件进行荧光强度计算,客观算出各样品光强度；(2)ELISA检测：用ELISA试剂盒进行99例患者血清8-OHdG浓度。(3)hOGG1 rs 1052133 SNP 与NPC预后关联性研究：按纳入标准入选的371例NPC患者均接受了根治性放疗,部分Ⅱb、Ⅲ、Ⅳ期病人还接受了诱导化疗或同期化疗或辅助化疗。所有患者均接受了随访。应用单因素和多因素分析方法研究这371例NPC患者hOGG1 rs1052133 SNP与他们的总生存率(overall survival,OS)和无瘤生存率(tumor-free survival, TFS)的相关性。(4).统计学分析：采用SPSS15.0统计软件包进行数据分析。三.结果1.NPC癌组织中hOGG1和8-OHdG表达与hOGG1rs 1052133 SNP目关性：(1)40例NPC患者的癌组织和15例粘膜慢性炎患者的炎症组织进行免疫荧光染色检测：NPC组织中8-OHdG表达强度显著高于慢性粘膜炎组织(P=0.003)。GG+GC型(P=0.004)、GC型(P=0.008)的NPC组织中8-OHdG表达强度明显高于慢性炎组织,GG型NPC组织中8-OHdG表达强度存在高于粘膜慢性炎组织的趋势(P=0.062)。 (2)ELISA检测结果：99例NPC患者中,GG型患者血清中8-OHdG含量要显著低于GC或CC者(P=0.038)。(3)hOGG1rs 1052133 SNP与NPC预后相关性：第一部分的488例NPC患者中共371例满足入选标准而纳入后续的生存分析。所有病人均接受了随访。中位随访时间为6-48月,随访过程中23例(6.2%)出现病情进展。随访结束时,共12例(3.2%)患者死于NPC进展。371例NPC患者hOGG1rs 1052133 SNP分型与OS的关系：仅有T分期(p=0.026)与OS显著相关,而CC基因型((P=0.139)与OS无显著相关性。371例NPC患者TFS的单因素分析结果显示：T分期(p＝0.018)、CC基因型(p=0.043)与TFS显著相关。多因素分析结果显示,T分期(HR 5.123,95%CI 1.199-21.886)、CC基因型(HR 2.539,95%CI 1.068-6.033)是影响NPC的TFS独立危险因子。3.我们还纳入339例晚期鼻咽癌患者(Ⅲ+Ⅳ期)进行hOGG1 rs1052133多态性与OS和TFS相关性分析。OS的单因素分析结果显示CC基因型(P=0.117)与OS无显著相关性。TFS的单因素分析结果显示,T分期(p=0.028)、CC基因型(p=0.076)与TFS存在相关趋势,而多因素分析结果显示,T分期(HR 7.235,95%CI 0.972-53.864)(p=0.053),CC基因型(HR2.368,95%CI 1.199-21.886) (p=0.061)存在独立影响TFS的趋势。四.结论1.鼻咽癌组织中8-OHdG表达率显著高于慢性粘膜炎组织,提示8-OHdG可能与鼻咽癌发生发展有关。2.携带GG基因型hOGG1的鼻咽癌患者血清8-OHdG浓度显著低于携带CC或GC的患者,提示GG基因型的hOGG1切除修复DNA损伤的功能可能较CC或GC基因型低下。3.hOGG1 rs 1052133 CC SNP可能是预测NPC治疗后进展的独立危险因素。第三部分hOGGl rs1052133 SNP与鼻咽癌相关的体外功能研究一.研究背景和目的：本研究第一部分的结果表明,携带hOGG1 rs1052133GG型者患NPC的风险较CC和GC型显著下降,提示该基因型是NPC的保护性因子,与一些报道并不一致。原因可能有：(1)以往的研究的病例数较少。(2)对于来自不同种族、地理环境的人群,其h OGG1 rs 1052133的不同基因型在NPC发病机制中的作用可能不同。有学者认为,携带GG基因型细胞中hOGG1修复功能下降,导致细胞DNA损伤积累过多,从而诱导细胞凋亡,防止细胞恶变。还有学者认为,GG基因型的hOGG1功能只有在有过度氧化应激压力的环境中才低于CC基因型。研究认为,健康人体内也可能存在肿瘤细胞,由于机体免疫系统的抑制而未发展和产生临床症状,与人体长期共存。免疫系统主要是通过细胞免疫来抑制杀伤肿瘤细胞。而免疫细胞也可通过产生ROS等活性氧物质使肿瘤细胞发生氧化损伤,从而导致其凋亡。我们第二部分的研究结果表明,CC型是预测NPC患者复发和远处转移的独立危险因子。研究表明,放疗和化疗药物也可通过诱导产生ROS来促使肿瘤细胞发生凋亡。结合本研究第一、二部分的研究结果及文献报道,我们提出以下假说,hO GG1rs 1052133SNP可能参与了NPC的发生、发展以及治疗后复发转移：1.人体鼻咽部可能存在无临床表现的隐匿癌,由于体内免疫细胞可产生ROS导致肿瘤细胞凋亡而未能进一步发展。如果受损伤的肿瘤细胞具备自我修复能力,就有增殖发展的机会。研究表明,携带CC型细胞自我修复的能力明显高于GG型者。因此,可以推测携带CC型SNP的肿瘤细胞自我修复的能力也应高于GG型细胞,因此前者发展成临床癌的风险可能要高于后者。肿瘤细胞自我修复能力越强,其增殖发展成具有临床表现的临床癌的机会就越大。2.NPC细胞在遭受根治性放疗及化疗的损伤后,是否复发和复发时间的长短,可能取决于肿瘤细胞损伤后修复的能力。治疗后修复能力越强,则复发机会越大及复发时间越短。CC基因型的hOGG1较强的修复能力可能是携带该SNPNPC患者的复发时间较短的原因之一。因此,为验证以上的假说,我们通过构建慢病毒hOGG1 rs 1052133 GG和CC型过表达载体,在体外转染人鼻咽癌细胞株,从而构建稳定携带h OGG1 rs1052133 GG和hOGG1 rs1052133 CC鼻咽癌细胞模型。通过观察其生物学特性的改变来研究该SNP对NPC发生和治疗后复发及远处转移的相关机理。二.材料和方法：1.实时荧光测定不同鼻咽癌细胞系及永生化正常鼻咽部上皮细胞系,包括HK1、HONE1、5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、NP69中hOGG1mRNA表达,结果发现HK-1细胞中表达量最低,故选该细胞系做后续细胞模型构建。2. hOGG1基因表达载体的慢病毒包装,感染HK1细胞建立包括空载慢病转染的HK-1 (N-HK-1),转染OGG1-CC基因型的HK-1(OGG1-CC-HK1),转染OGG1-GG基因型HK-1(OGG1-GG-HK1)。荧光显微镜观察转染细胞转染效率。qPCR测定稳定转染后的N-HK1,OGG1-CC-HK1,OGG1-GG-HK1细胞中hOGG1mRNA表达水平。Western-blot(WB)检测各组细胞hOGG1蛋白的表达。测序鉴定OGG1-CC-HK1,OGG1-GG-HK1细胞中目标基因序列。3.MTT法进行HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1细胞无氧化应激压力下增殖活力检测。4.光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)干预后不同细胞模型修复能力的检测：应用低剂量5一氨基酮戊酸(5一ALA)作为光敏剂的PDT,对HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1细胞进行照射,MTT检测照射前后细胞活力,从而分析各细胞模型的损伤修复能力。5.细胞内免疫印迹(in-cell Western,ICW)检测5-ALA-PDT后8-OHdG/hOGG1的变化。6.ELISA检测5-ALA-PDT处理后各细胞模型培养液上清中8-OHdG含量。7.流式细胞仪检测各细胞模型照射前后在细胞周期各阶段的细胞比率。8.我们还将PDT前后各组细胞,包括N-HK1、OGG1-CC-HK1、 OGG1-GG-HK1进行转录组测定,分析OGG1rs1052133 SNP对各组细胞基因的表达的影响。三.结果1.qPCR测定慢病毒稳定转染细胞后目的基因表达情况：稳定转染后的HK1细胞中OGG1-GG-HK1和OGG1-CC-HK1mRNA表达水平约是空载N-HK1的2.3倍。WB检测发现OGG1-GG-HK1和OGG1-CC-HK1 hOGG1蛋白表达量略高于N-HK1细胞；2.测序结果：在两种稳定转染细胞株细胞OGG1-CC-HK1,OGG1-GG-HK1中提取nRNA,并逆转成cDNA后送测序鉴定。结果显示两个目的序列仅在rs1052133突变位点存在CC/GG变异外,其余序列均不变。3.无应激压力时各细胞株生长情况：结果显示OGG1-GG-HK1细胞在新接种后的第2、3、4天活力略弱于其他各组(P0.01);4.5-ALA-PDT处理后各细胞系的修复能力测定：计算PDT后12h,18h,24h,36hMTT吸光度值与6h吸光度值的比值,检测各组比值随时间变化情况。结果显示,转染了hOGG1基因的两个实验组比值较N-HK1和HK1组显著增高,显示出前者更快的修复能力,而OGG1-GG-HK1的修复能力要略弱于野生型OGG1-CC-HK1细胞,在PDT后24h表现尤为明显,24h后在各组间P0.05,有统计学差异。6. ICW检测PDT前后各组细胞内8-OHdG与hOGG1比值变化：无损伤应激的情况下(PDT前),OGG1-GG-HK1细胞中单位8-OHd G的含量明显低于其他各组,而在氧化损伤后18h,24h OGG1-GG-HK1细胞中单位hOGG1含量下8-OHdG明显上调,提示在修复过程中OGG1-GG基因型修复功能可能略弱于OGG1-CC基因型。7.转录组测定结果显示,OGG1-GG-HK-1在PDT后24h的hOGG1mRNA水平较OGG1-CC-HK-1(约2.6倍),而前者PDT前与PDT后24h该mRNA水平并无差别。OGG1-CC-HK-1在PDT后24h的mRNA水平较PDT前增加约2.23倍,提示OGG1-CC-HK-1可能具备氧化损伤后通过增加hOGG1表达来提高修复效率的能力,而OGG1-GG-HK-1并没有该能力。本研究结果还显示OGG1-CC-HK-1中SLC39A10 mRNA PDT前上调,PDT后进一步上调至对照的2.4倍,而OGG1-GG-HK-1 PDT前该基因下调,PDT后无改变。在PDT前,OGG1-GG-HK1的DUSP6,DUSP4和LAPTM5 mRNA均上调,而在OGG1-CC-BK1中下调；PDT后,前者中这些基因的mRNA表达仍高于后者。PDT前OGG1-GG-BK1的GADD34 mRNA上调,而PDT后无变化。OGG1-CC-HK1中该基因在PDT前下调,PDT后由原来的下调逆转为上调。四.结论1.成功构建稳定转染的OGG1-CC-HK-1和hOGG1-GG-HK-1鼻咽癌细胞模型。2. OGG1-CC-HK-1在光动力治疗后修复能力高于OGG1-GG-HK-1。这可能与后者在氧化应激压力环境下hOGGl功能下调和ml RNA水平下降有关。3.hOGG1rs1052133SNP可通过改变多个下游基因,包括SLC39A10、 DUSP6、DUSP4、LAPTM5、GADD34的表达来影响HK1细胞的凋亡活性。第四部分hO6G1rs1052133多态性在荷瘤裸鼠体内的功能研究一.研究背景和目的：hOGG1rs1052133 SNP对NPC细胞的影响还需要在动物肿瘤模型中进行验证。动物肿瘤模型对于恶性肿瘤发生机制的研究具有重要意义,其主要分为以下几类：(1)自发肿瘤模型；(2)诱发肿瘤模型；(3)基因修饰肿瘤模型；(4)移植性肿瘤模型。其中移植性肿瘤模型目前应用较为广泛,主要分为同种移植性肿瘤模型和异种移植性肿瘤模型。移植性肿瘤模型目前应用较多的是裸鼠,该模型具有以下优点：(1)成瘤率稳定,且个体之间肿瘤生长速度较一致,个体差异小；(2)模型建立时间较短、操作方便；(3)移植瘤能够保持原发瘤的生物学特性和病理特性；(4)所用的免疫缺陷动物细胞免疫功能低下。因此肿瘤,特别是来源于人类的异体肿瘤移植成功率高,几乎所有的肿瘤均能在裸鼠体内形成肿瘤。在本研究第三部分中,我们应用NPC细胞株进行hOGG1 SNP的体外功能研究。但体外实验结果意义有限,因为体外单层培养的肿瘤细胞的生物学特性与活体内三维实体肿瘤细胞群体有明显的差异,体内肿瘤细胞群体处于细胞与细胞以及细胞与基质相互作用的肿瘤微环境中,这是体外实验所无法模拟的。因此在本部分的研究中,我们应用BALB/c裸鼠建立N-HK1、hOGG1rs1052133 GG-HK-1和hOGG1rs1052133 CC-HK-1移植瘤模型,来探讨hOGG1过表达以及rs1052133 S IP在活体内对NPC细胞系HK-1的影响。我们相信在裸鼠等活体内的研究结果比体外实验更能够客观反映hOGG1及其SNP在NPC发生、发展、复发转移中的机制。二.实验方法：1.HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1细胞复苏、培养、传代、计数；2.动物分组：用随机数字表将动物随机分成4组,分别为HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1移植组,每组5只。3.细胞准备与接种：收集HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1细胞,配置成细胞悬液注射入裸鼠右腋皮下,每隔1天用游标卡尺测量肿瘤大小,接种后1月,断颈处死小鼠,取肿瘤称重。4.实时荧光定量PCR检测移植瘤内hOGG1mRNA水平。5.测序鉴定HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、OGG1-GG-HK1细胞组内hOGG1基因rs1052133 SNP的情况。三.结果移植瘤成瘤情况：HK1、N-HK1、OGG1-CC-HK1、 OGG1-GG-HK1四组细胞均在裸鼠体内成瘤,成瘤率100%。出瘤时间大约在接种后第5-8天,前三周肿瘤生长较为缓慢,最后一周生长速度明显加快。4组间瘤体重量两两比较差异无统计学意义,但未转染hOGGl的HK1和N-HK1的移植瘤合并组与转染hOGGl的OGG1-CC-HK1和OGG1-GG-HK1合并组进行比较,前者的平均瘤重明显小于后者(0.360g±0.16g vs 0.591±0.23)(P=0.021)。四.结论1.本研究成功构建了hOGG1过表达HK-1移植瘤裸鼠模型(HK--1、N-HK1、 OGG1-GG-HK-1和OGG1-CC-HK-1),为今后进一步研究该SNP与NPC发生、发展等研究提供平台。2.hOGGl过表达能够促进裸鼠移植鼻咽癌HK-1细胞的增殖。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.63

【参考文献】