金属纳米粒和膜联蛋白A2受体在新生血管形成中的作用研究

发布时间：2018-03-08 22:31

  本文选题：视网膜新生血管　切入点：金纳米棒　出处：《第二军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分金纳米棒抑制新生血管形成的作用研究目的研究金纳米棒(Gold nanorods,GNRs)被细胞内吞的途径及其特异性抑制体外血管形成的作用及机制。方法利用种子生长法合成GNRs并进行聚乙二醇修饰(PEGYlated GNRs),并检测合成的GNRs各项表征及在细胞培养基中表征的变化。我们进一步利用化合物抑制剂和小干扰RNA研究GNRs入胞的机制;采用细胞增殖、细胞迁移及管样形成等方法研究GNRs对HREC功能的影响;利用激光共聚焦检测GNRs对HREC细胞骨架的影响;利用流式细胞仪检测GNRs对HREC细胞周期的影响;最后利用Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果我们利用改进的种子生长法合成列纵横比大、纯度高的GNRs,并成功修饰巯基聚乙二醇,该纳米棒可以吸附细胞培养基及细胞分泌的蛋白形成蛋白晕,该蛋白晕进一步改变了GNRs的特性。GNRs入胞的机制是时间依赖的,不同时间机制不同。同时,我们发现该GNRs可以特异性抑制HREC的增殖、迁移、管样形成及引起HREC细胞骨架的变化。其抗血管功能是通过抑制HREC细胞周期于G1期,并抑制细胞周期相关蛋白的表达。结论GNRs通过诱导细胞周期阻滞特异性抑制内皮细胞增殖而对其它细胞无影响,使其在治疗新生血管疾病上展现很大潜力。第二部分氧化亚铜纳米粒抑制新生血管形成的作用研究探索氧化亚铜纳米粒(Cuprous oxide nanoparticles,CO-NPs)对新生血管生成的影响及其可能机制。目的方法利用液相氧化还原法合成CO-NPs并利用Ed U试剂盒检测CO-NPs对脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖的影响;用倒置相差显微镜观察CO-NPs处理后HUVEC形态的变化;利用Transwell实验检测CO-NPs对HUVEC迁移能力的影响;利用管样形成实验检测CO-NPs对HUVEC管样形成能力的影响;利用体外注射Matrigel胶实验检测CO-NPs对体外新生血管形成能力的影响;流式细胞仪检测CO-NPs对细胞周期和凋亡的影响;利用Western blot和RT-PCR检测CO-NPs抑制体外新生血管形成的机制。结果合成的CO-NPs具有丁达尔现象、粒径约60nm并且带有正电荷;CO-NPs处理后死亡细胞显微镜下呈现透亮变圆的形态;CO-NPs可以明显抑制HUVEC的增殖、迁移及体内外血管生成。CO-NPs可以明显抑制细胞周期于S期并促进细胞凋亡。CO-NPs抑制新生血管的机制是通过下调血管生成因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)的表达。结论CO-NPs通过特异性抑制VEGFR2表达发挥其抗血管作用,可能成为靶向治疗新生血管性疾病的新物质。第三部分干扰膜联蛋白A2受体抑制新生血管形成的作用研究目的探索干扰AXⅡR表达后对体外新生血管形成的影响及其可能机制。方法Western blot和RT-PCR检测脂质体转染AXⅡR后的干扰效率。利用Ed U实验检测干扰AXⅡR对HUVEC增殖的影响;利用Transwell实验检测干扰AXⅡR对HUVEC迁移能力的影响;通过细胞粘附实验检测干扰AXⅡR后HUVEC粘附能力的改变;利用管样形成实验检测干扰AXⅡR对HUVEC管样形成能力的影响;体外注射Matrigel胶实验检测干扰AXⅡR对体外新生血管形成能力的影响;流式细胞仪检测干扰AXⅡR后对细胞周期和凋亡的影响;最后用Western blot和RT-PCR检测干扰AXⅡR后抑制体外新生血管形成的机制。结果AXⅡR在HUVEC中表达,并且si AXⅡR可以明显抑制AXⅡR在m RNA和蛋白水平的表达;si AXⅡR可以明显抑制HUVEC的增殖、迁移、粘附及体内外血管生成。si AXⅡR可以明显抑制细胞周期于S期而对细胞凋亡无明显影响;最后我们证明si AXⅡR通过抑制基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases)2和9的表达进而发挥抑制新生血管的作用结论本研究表明AXⅡR血管内皮细胞增殖、迁移、黏附等方面发挥重要作用,可能成为治疗新生血管的新靶点。第四部分氧化亚铜纳米粒抑制葡萄膜黑色素瘤的作用研究目的探索CO-NPs对脉络膜黑色素瘤(Uveal melanoma,UM)的影响及可能的机制。方法利用Western blot和蛋白质谱分析研究了CO-NPs与细胞共孵育后表征的变化;利用CCK-8实验检测了CO-NPs对UM细胞系(C918)、人肾癌细胞系(A498)、视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelium cell,RPE)和人胚肾细胞(293T)增殖的影响;利用Transwell小室检测了C918细胞的迁移和侵袭能力;利用激光共聚焦检测了C918形态的变化;利用化学抑制剂探索了C918内吞CO-NPs的途径;.利用投射电镜探索了CO-NPs在C918细胞内的定位;利用流式细胞仪检测CO-NPs对线粒体膜电位的影响;利用TUNEL实验检测CO-NPs对细胞凋亡的影响;利用激光共聚焦检测CO-NPs对细胞自噬的影响;最后利用Western blot检测CO-NPs对细胞自噬和凋亡的影响结果CO-NPs与细胞孵育后可以吸附血清中的蛋白,使得CO-NPs电位由正变负;CO-NPs可以特异性的抑制肿瘤细胞增殖而对正常细胞无影响;CO-NPs可以浓度依赖的抑制C918细胞的迁移和侵袭并改变细胞骨架结构;CO-NPs主要通过脂筏结构进入细胞,并定位于自噬体和线粒体;CO-NPs可以导致线粒体功能异常并诱导产生活性氧;CO-NPs可以诱导细胞凋亡并促进凋亡相关蛋白活化;CO-NPs可以促进细胞自噬并影响相关蛋白表达。结论CO-NPs可以特异性抑制UM细胞迁移和侵袭,有望成为治疗UM的新方法。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R774.1

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