缝隙连接蛋白26相关迟发性非综合症型遗传性耳聋小鼠模型的建立及对噪声易感性的研究

发布时间：2018-03-10 23:23

  本文选题：缝隙连接蛋白26　切入点：他莫昔芬　出处：《华中科技大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分Connexin26相关迟发性非综合症型遗传性耳聋小鼠模型的建立及鉴定目的：建立及鉴定Connexin26相关迟发性非综合症型遗传性耳聋小鼠模型。方法：使用Cx26loxp/loxP小鼠与Rosa26CreER小鼠杂交,最终获得Cx261oxP/loxP; Rosa26CreER小鼠。在Cx26loxP/loxP; Rosa26CreER小鼠出生后第18天(Postnatal Day 18,P18)给予单次他莫昔芬(Tamoxifen,TMX)腹腔注射；以Cx26loxP/loxP小鼠出生后第18天给予单次他莫昔芬腹腔注射作为对照。基因分型(Genotyping)用来确定小鼠的基因型,蛋白印迹杂交(Western Blot)用来检测小鼠耳蜗内Cx26表达水平。听性脑干反应(Auditory Brainstem Response,ABR)检测小鼠听力。结果：蛋白印迹杂交结果显示,敲除组小鼠1月龄时耳蜗Cx26表达量下降。ABR结果提示敲除组小鼠在1月龄时听力正常,5月龄时出现8-32KHz大于50dB SPL的听力损失。结论：我们成功地建立了Cx26相关迟发性非综合症型遗传性耳聋小鼠模型。第二部分Connexin26相关迟发性非综合症型遗传性耳聋小鼠对噪声易感性的研究目的：研究Connexin26相关迟发性非综合症型遗传性耳聋小鼠对噪声的易感性。方法：将实验动物分为对照组、敲除组、噪声组与敲除+噪声组。其中对照组与噪声组均使用Cx26loxP/loxP小鼠,而敲除组及敲除+噪声组均使用Cx26loxP/loxP; Rosa26CreER小鼠。上述小鼠均在出生后第18天给予单次他莫昔芬腹腔注射,其中噪声组与敲除+噪声组在出生后第25天开始给予噪声暴露,刺激强度110dBSPL,每天8小时,连续5天。在30日龄时采用蛋白印迹杂交(Western Blot)和免疫荧光技术(Immunofluorenscence)检测耳蜗Cx26蛋白的表达水平。在30口龄与45口龄时采用听性脑干反应(Auditory Brainstem Response,ABR)检测小鼠的听阈。结果：蛋白印迹杂交和免疫荧光结果显示,在30日龄时敲除组与敲除+噪声组小鼠耳蜗Cx26表达下降。ABR结果显示,在30日龄时,对照组与敲除组小鼠听力未见明显异常；噪声组与敲除+噪声组小鼠均表现为8-48KHz的重度听力损失。在45日龄时,对照组与敲除组小鼠听力仍未见明显异常；噪声组小鼠8-32KHz听阈较30日龄时有所恢复,而敲除+噪声组小鼠听力无明显恢复。结论： 出生后第18天敲除Cx26,在45日龄以前不会造成小鼠听力损伤。连续高强度噪声刺激会对正常小鼠造成中-重度听力损伤,其8-32KHz听力损伤部分可逆；连续高强度噪声刺激对迟发性Cx26敲除小鼠造成重度听力损伤,该听力损伤无法恢复。第三部分Connexin26相关迟发性非综合症型遗传性耳聋小鼠模型声损伤耳蜗细胞死亡模式的研究目的：探索Cx26相关迟发性非综合症型遗传性耳聋小鼠模型声损伤后耳蜗细胞死亡模式。方法：将实验动物分为对照组、敲除组、噪声组与敲除+噪声组。其中对照组与噪声组均使用Cx26loxP/loxP小鼠,而敲除组及敲除+噪声组均使用Cx261oxP/loxP; Rosa26CreER小鼠。上述小鼠均在出生后第18天给予单次他莫昔芬腹腔注射,其中噪声组与敲除+噪声组在出生后第25天给予噪声暴露,刺激强度110dB SPL,每天8小时,连续5天。在30 H龄与45日龄时采用基底膜铺片定量分析毛细胞损伤,在45日龄时采用树脂包埋轴位切片观察耳蜗细胞损伤模式,透射电镜观察耳蜗血管纹细胞的超微病理变化。结果：在30日龄时,对照组与敲除组小鼠毛细胞未见明显缺失。噪声组小鼠耳蜗底回出现最高达17.8%的外毛细胞缺失,而敲除+噪声组小鼠耳蜗中至底回出现17.0%-56.1%的外毛细胞缺失；上述两组小鼠内毛细胞未见明显缺失。在45口龄时,对照组与敲除组小鼠毛细胞未见明显缺失。噪声组小鼠耳蜗外毛细胞损伤范围稍有扩大,底回出现最高达25.5%的外毛细胞缺失；敲除+噪声组小鼠耳蜗中至底回出现17.6%-60.0%的外毛细胞缺失。半薄切片提示：上述四组小鼠耳蜗外侧壁、血管纹与支持细胞光镜下未见明显异常。电镜结果提示：敲除+噪声组小鼠血管纹中间细胞线粒体形态异常。结论：出生后第18天敲除Cx26,在45日龄以前不会造成明显的毛细胞缺失。连续高强度噪声刺激会造成正常小鼠耳蜗底回少量外毛细胞缺失。连续高强度噪声刺激对迟发性Cx26敲除小鼠造成中-底回部分外毛细胞缺失。连续高强度噪声刺激后耳蜗血管纹中间细胞出现异常线粒体。第四部分出生后早期降低Connexin26表达对柱细胞微管的影响目的：探索出生后早期降低Connexin26表达对柱细胞微管的影响。方法：将实验动物分为对照组和敲除组：Cx26loxP/loxP小鼠及Cx26IoxP/1oxP; Rosa26CreER小鼠出生后第1天颈背部皮下注射他莫昔芬。在出生后第4天和第9天采用免疫荧光染色观察敲除组与对照组耳蜗Cx26表达水平。出生后第9天和第18天半薄切片观察耳蜗形态。透射电镜观察柱细胞超微病理变化。结果：免疫荧光结果显示：敲除组小鼠出生后第4天及第9天耳蜗Cx26表达量较对照组降低。半薄切片结果显示：出生后第9天对照组小鼠耳蜗顶中底三回Corti器发育良好,Corti隧道已开放,Nuel间隙形成,而敲除组小鼠耳蜗顶中底三回Corti隧道均未能打开,Nuel间隙未能形成。敲除组小鼠在出生后第18天时耳蜗顶中底三回Corti隧道仍未能打开,Nuel司隙仍未形成。敲除组小鼠耳蜗基底膜中回与底回可见Corti器支持细胞与毛细胞缺失,外侧壁与血管纹光镜下结构未见明显异常。透射电镜观察结果：出生后第9天对照组耳蜗柱细胞内可见大量呈束状排列微管,其间可见线粒体,而敲除组小鼠耳蜗柱细胞中仅有少量微管排列。结论：出生后第1天降低耳蜗Cx26表达后,耳蜗Corti隧道不能开放,柱细胞内微管数量减少。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R764.43;R-332

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本文编号：1595530