间歇性低氧小鼠模型中内皮祖细胞修复机制的研究

发布时间：2018-03-21 04:34

  本文选题：阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)　切入点：间歇性低氧(IH)　出处：《天津医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的:阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)已成为影响民众健康的负担之一,亦是高血压、冠心病等心脑血管疾病的独立危险因素。OSA主要的病理生理特征就是间歇性低氧(IH),而OSA下IH模式会引起血管内皮损伤。而IH模式下的血管内皮损伤过程与内皮祖细胞(EPC)的招募和归巢引发的修复过程之间存在一个平衡,而这个平衡关系将决定OSA病人的血管功能。所以,我们主要探究IH小鼠模型中外周血内皮祖细胞(EPC)对受损血管内皮的修复机制。实验方法:模拟OSA模式进行间歇性低氧(IH)暴露模型构建。将60只7周大小、体重在26-30克之间的C57BL/6J雄性小鼠随机的分为间歇正常氧组(n=15)、轻度间歇低氧组(n=15)、中度间歇低氧组(n=15)和重度间歇低氧组(n=15)。密度梯度离心法获取小鼠外周血单个核细胞(PBMC),根据乙醛脱氢酶(ALDH)活性并联合相应的EPC细胞表面标志物CD133,CD34和含激酶插入受体(KDR),利用流式细胞仪分别测定不同分类的EPC(包含CD133+KDR+EPC,CD133+CD34+EPC,CD34+KDR+EPC和ALDHlowCD34+KDR+EPC)水平;分别评价小鼠血清中基质细胞因子-1α(SDF-1α),低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的浓度水平,用酶联免疫吸附法(ELISA);分离孵育小鼠外周血的单个核细胞以结合植物荆豆凝集素-I(UEA-I)、摄取乙酰化的低密度脂蛋白(Dil-ac LDL),而后计算双染梭形细胞数及双染细胞总数,来评价EPC增值能力并鉴定EPC;依据Transwell小室模型测定EPC的迁徙数量以评估EPC迁移能力;利用Western Blot测定EPC表面膜蛋白(CXCR4和VEGFR2)的表达程度;将不同程度间歇低氧后EPC的培养基培养内皮细胞(EC)于Matrigel上,观察并评估EPC对内皮新生血管生成能力的影响。选用SPSS 18.0软件行本实验数据的统计分析。实验结果:(1)采用呼吸仿真系统模拟OSA模式间歇性低氧(IH)暴露模型构建成功,并根据此系统设计如下低氧方案:间歇正常氧组(21%O2),轻度间歇低氧组(15%O230s),中度间歇低氧组(10%O230s),重度间歇低氧组(5%O230s)。(2)流式细胞计数仪呈现并计算其结果:各组小鼠外周血CD133+KDR+EPC,CD133+CD34+EPC和CD34+KDR+EPC程度呈明显差异(为F=1163.164、650.383、676.123,P均0.001)且随间歇低氧程度加重而升高。CD133+KDR+EPC水平具体为重度IH组水平CD133+KDR+EPC(0.450±0.013)中度IH组(0.426±0.013)轻度IH组(0.276±0.011)间歇正常氧组(0.242±0.010);CD133+CD34+EPC水平为重度IH组(0.320±0.010)中度IH组(0.268±0.011)轻度IH组(0.183±0.014)间歇正常氧组(0.138±0.015);CD34+KDR+EPC水平为重度IH组(0.532±0.008)中度IH组(0.496±0.005)轻度IH组(0.463±0.008)间歇正常氧组(0.362±0.018);但是小鼠外周血ALDHlowCD34+KDR+EPC(F=372.758,P0.001)水平为轻度IH组较间歇正常氧组升高,中、重度IH组逐渐降低且在重度IH组水平最低,具体为轻度IH组(0.425±0.013)间歇正常氧组(0.346±0.011)中度IH组(0.328±0.011)重度IH组(0.286±0.012)。(3)ELISA测定的各个组小鼠血清SDF-1α、HIF-1α和VEGF的浓度程度差异明显,具体为(F=512.300、250.500、1638.000,P均0.001),且随间歇低氧程度加重细胞因子水平逐渐升高具体依次为重度IH组(2060.330±52.530,2.137±0.165,149.700±7.070)中度IH组(1825.670±78.800,1.789±0.060,91.600±6.030)轻度IH组(1422.800±108.300,1.508±0.048,51.340±2.750)间歇正常氧组(1063.600±44.890,1.141±0.098,31.110±2.510)。(4)摄取Dil-ac LDL并结合FITC-UEA-I后双染阳性的梭形细胞数差异明显(F=153.617,P0.001)(个/视野),轻度IH组数目最多,间歇低氧程度加重后梭型细胞数目逐渐降低,具体为轻度IH组(12.330±1.877)间歇正常氧组(7.67±1.047)中度IH组(5.13±1.187)重度IH组(2.20±1.082);总的双染阳性细胞数目差异亦显著(F=1704.674,P0.001),轻度IH组双染细胞数目最多,随着间歇低氧程度加重后细胞数目逐渐降低,具体为轻度IH组(94.67±0.735)间歇正常氧组(71.67±0.667)中度IH组(58.33±2.350)重度IH组(30.13±0.593)。(5)Transwell模型计算各组小鼠外周血EPC的迁移数目差异显著(F=648.724,P0.001),且在轻度IH组迁移细胞数目最明显,中、重度IH组迁移细胞数目逐渐降低,重度IH组数目最少,具体为轻度IH组(54.130±2.0642)间歇正常氧组(42.730±2.520)中度IH组(27.870±3.502)重度IH组(11.800±2.366)。(6)Western Blot实验测定各组小鼠外周血EPC的表面受体CXCR4和VEGFR2的蛋白表达水平差异较显著(F=648.724,P0.001),在轻度IH组水平最高,中度IH、重度IH组逐渐降低,且在重度IH组中水平最低,具体为轻度IH组(54.130±2.0642)间歇正常氧组(42.730±2.520)中度IH组(27.870±3.502)重度IH组(11.800±2.366)。(7)不同组EPC的培养基培养内皮细胞(EC)于Matrigel上所形成的平均血管长度差异明显(F=1568.000,P0.001),且轻度IH组的平均血管长度最长,中、重度IH组逐渐降低,重度IH组平均血管长度最短,具体为轻度IH组(400.500±13.100)间歇正常氧组(219.700±13.410)中度IH组(170.300±9.788)重度IH组(100.500±13.470)。结论:(1)通过间歇性低氧(IH)处理模拟OSA模式IH下的小鼠模型在轻度IH后,血清中细胞因子被大量激活,EPC动员增加并迁移到受损的血管内皮处,形成的新生内皮血管增多,EPC的修复能力增强;而中、重度IH后,虽然机体EPC动员增加,细胞数目增多,但却动员招募了大量功能较差的的EPC(ALDHhighCD34+KDR+EPC),而真正有修复功能的EPC(ALDHlowCD34+KDR+EPC)并未增加甚至减少,新生内皮血管较少,此时修复能力减弱。(2)轻度IH后,小鼠外周血EPC的动员、招募、增值、趋化、归巢和生成血管能力增强,但是随着间歇性低氧程度加重(即中、重度IH后)EPC的增值、趋化、归巢和生成血管能力却大大减弱,最终导致内皮损伤与内皮祖细胞的修复之间的动态失衡,对损伤的内皮修复功能减弱,从而使一些心血管等疾病的发病风险大大升高。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R-332;R766

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