难治性眼底病中炎症细胞因子产生的机制研究

发布时间：2018-03-22 05:16

本文选题：视网膜色素上皮细胞　切入点：白细胞介素-6　出处：《重庆医科大学》2012年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分：眼视网膜色素上皮细胞中蛋白酶体抑制剂MG-132通过活化P38MAPKs细胞信号通路促进了白细胞介素-6的表达目的老年性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）随着年龄的增长发病率呈上升趋势，近年来在防治老年性黄斑变性的研究中眼视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）功能的变化成为研究热点。我们发现老龄化的视网膜色素上皮细胞中蛋白酶体（proteasome）的活性逐渐下降，并且许多研究显示炎症细胞因子（inflammatory cytokines）在老年黄斑变性的发生发展中发挥了重要作用，白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）是其中重要的一种细胞因子。本章我们用抑制蛋白酶体活性的试剂MG-132来模拟年龄增长所导致的蛋白酶体活性下降的这一自然现象，从而更好地研究蛋白酶体的活性下降对眼视网膜色素上皮细胞产生炎症细胞因子IL-6的影响及作用机制。方法我们先将人RPE细胞系（ARPE-19）分成两组培养，一组只加DMEM（其内含10%FBS，100U/ml penicillin G和100μg/ml streptomycin），另一组加DMEM（内含成分同上）和10μM MG132，然后分别在2小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时等时间点，首先收集细胞培养上清，用酶联免疫吸附试验（ELISA）测白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）和单核细胞趋化蛋白-1（mono-cytechemo-attractant protein-1，MCP-1）的含量。再收集1小时，4小时，8小时等时间点的RPE细胞，用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time polymerase chainreaction，Real-time PCR）测IL-6的mRNA（Messenger Ribonucleic Acid，信使核糖核酸）含量。然后我们用蛋白质印迹法（Western-blotting法，WB法）和电泳凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）测定MG-132是否可以激活调控IL-6分泌的两条主要细胞信号通路P38-丝裂原激活的蛋白激酶途径（P38Mitogen-Activated Protein Kinases，P38MAPKs）和c-Jun氨基端激酶（c-JunN-terminal Kinase, JNK，另一条重要的MAPKs）。再在细胞培养液DMEM中加入这些细胞信号通路的抑制剂，用ELISA方法测细胞培养上清中IL-6的含量，以便于观察哪个信号通路的抑制剂可以抵消MG-132促进IL-6分泌的作用。结果蛋白酶体抑制剂MG132增加了视网膜色素上皮细胞IL-6的mRNA水平和蛋白质水平的表达，却降低了MCP-1的分泌。MG132可以激活调控IL-6分泌的两条主要细胞信号通路P38MAPKs和c-Jun氨基端激酶。P38MAPKs的抑制剂-SB203580加入RPE培养液后不仅可以降低视网膜色素上皮细胞产生IL-6的基础分泌，而且可以抵消MG-132促进IL-6分泌的作用；而当加入JNK的抑制剂-SP600125后，虽然也可以降低IL-6的基础分泌，但却不能抵消MG-132促进IL-6分泌的作用。结论在眼视网膜色素上皮细胞中，蛋白酶体活性的抑制剂MG132可以通过激活P38MAPKs细胞信号通路来促使IL-6的产生。第二部分：在实验性自身免疫性葡萄膜炎中CD4+T淋巴细胞上死亡受体-3表达的增加促进了白细胞介素-17的分泌目的目前大量临床及基础实验资料表明死亡受体-3（Death Receptor3，DR3，又名肿瘤坏死因子受体超家族-25，Tumor necrosis factor receptor super-family-25,TNFRSF-25）在自身免疫性疾病（autoimmune diseases）中发挥了重要作用。葡萄膜炎（uveitis）是眼科常见的一种自身免疫性疾病，以前认为CD4+T淋巴细胞（CD4~+T cells）产生的白细胞介素-12（Interleukin-12，IL-12）\干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）免疫细胞因子通路在葡萄膜炎的发生发展中起着主要作用，但现在的研究表明白细胞介素-23（Interleukin-23，IL-23）\白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）免疫因子通路发挥了更为重要的作用。我们主要研究了在实验性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis，EAU）中，CD4+T淋巴细胞上死亡受体-3的量的变化及其与IL-17的关系。方法通过在小鼠的足底皮下注射200μl光感受器间维生素A类结合蛋白161-180（interphotoreceptor retinoid-binding protein161-180，IRBP161-180）与完全弗氏佐剂（Complete Freund’s adjuvant，CFA）的混合物诱导了小鼠B10.RIII的自身免疫性葡萄膜炎的动物模型，并对其进行临床及眼组织病理学方面的观察及评分。实验中，，将小鼠分为三组：①对照组（Control group，CONT），即足底皮下注射200μl磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）和完全弗氏佐剂的乳化混合物，②实验性自身免疫性葡萄膜炎组（experimental autoimmune uveitis group，EAU），即小鼠的足底皮下注射200μl光感受器间维生素A类结合蛋白与完全弗氏佐剂的混合物，③已恢复组（recovery phase mice group，Recovery），即注射光感受器间维生素A类结合蛋白与完全弗氏佐剂的乳化混合物后的4至5周以后，也就是眼内炎症已经完全消退的小鼠。然后处死小鼠收集其淋巴结（draining lymph nodes，DLNs），一部分淋巴结提取总蛋白，用蛋白质印迹法（Western-blotting，WB）测其中肿瘤坏死因子配体相关分子-1A （Tumor necrosis factor ligand associatedmolecular-1A，TL1A，即DR3的配体，又名肿瘤坏死因子超家族-15，Tumor necrosisfactor super-family-15，TNFSF-15）的含量，另一部分淋巴结在无菌条件下分离出淋巴细胞后，用磁珠细胞分选的方法分离出CD4+T cells。与此同时，一些CD4+Tcells被分为两组，一组细胞培养液1640中加入重组的TL1A和抗CD3与抗CD28的抗体，另一组培养液中不加TL1A，只加抗CD3与抗CD28的抗体，刺激3天后收集上清，用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA）测IL-17的含量。另一些CD4~+T cells被提取总蛋白和mRNA（Messenger RibonucleicAcid，信使核糖核酸），分别用蛋白质印迹法和实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR）测细胞中DR3的含量。结果临床和组织病理学结果显示，被光感受器间维生素A类结合蛋白161 180与完全弗氏佐剂的乳化混合物免疫的小鼠产生了严重的眼内炎症，在诱导14天后炎症达到高峰，4-5周以后眼内炎症完全消退。CD4~+T cells中DR3的mRNA和蛋白质水平在对照组和已恢复组中的含量相似，但在实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠组（7或14天）要高于对照组和已恢复组，而21天的EAU组CD4~+T cells中DR3的mRNA水平和蛋白质含量和其他两组比较无明显统计学差异。老鼠淋巴结中DR3的配体TL1A的含量在EAU（14天）组中最多，明显高于对照组和已恢复组，而后两组中TL1A的含量无明显统计学差异。另外，TL1A能促进CD4~+T cells产生IL-17，更重要的是相对于其他两组，EAU（14天）组的CD4~+T cells被TL1A刺激后可以产生更多的IL-17，而对照组和已恢复组的CD4~+T cells被刺激后增加的IL-17的量相比无统计学差异。结论在实验性自身免疫性葡萄膜炎的疾病过程中，死亡受体-3的含量在被完全弗氏佐剂与光感受器间维生素A类结合蛋白161-180的乳化混合物免疫的小鼠14天时，即老鼠眼内炎症最重时最多，之后其含量逐渐减少到和对照组小鼠相似的水平，其量的变化可能影响了小鼠CD4~+T cells分泌IL-17，从而参与了EAU的发生发展。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R774.1

【参考文献】