胚胎干细胞来源的角膜缘上皮样细胞及角膜内皮样细胞构建组织工程全厚角膜的研究

发布时间：2018-03-23 03:16

  本文选题：APCM　切入点：组织工程角膜支架　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：角膜疾病占全世界致盲性眼病的第二位,全世界超过1000万人因为角膜疾病而致盲。目前,对于角膜盲患者来说,角膜移植仍然是唯一确切有效的治疗方法。但是因为目前捐献的角膜材料严重缺乏,而使很多因角膜疾病而致盲的患者很难获得及时而且有效的治疗。因角膜供体缺乏,我国每年实施手术的病人还不到4000例,而每年需行角膜移植的患者却达到约30万。在这种情况下,人造角膜替代品成为了当前研究的热点。人工角膜(Keratoprosthesis)虽然已被批准应用于临床,但因生物相容性差、术后并发症多,难以在临床上推广。组织工程角膜(Tissue-engineered cornea,TECs)角膜是将体外培养的角膜细胞接种于可降解的生物支架材料上构建的与天然角膜具有相似的功能和结构的角膜替代物。因为其生物相容性具良好的,而受到了广泛的关注。角膜组织工程在近几十年来研究取得了较大进展。脱细胞猪角膜基质(Acellular porcine cornea matrix,APCM)及重组的人胶原在临床或实验动物前板层角膜移植中取得良好效果。但对于多种角膜疾病来说,如圆锥角膜、角膜穿孔等,穿透性角膜移植仍是广泛应用的手术方式。由于传统观念的影响,在我国角膜捐献率较低,而角膜屈光手术的开展使适于穿透性移植的角膜供体进一步减少。构建组织工程全厚角膜植片是解决当前穿透性角膜移植供体不足问题的可行的方法。此外,角膜所包含的细胞类型相对较少,主要有内皮细胞、上皮细胞和角膜基质细胞。相对于其他器官来说,构建TECs角膜更简单、易行。TECs的两个关键成分是种子细胞以及其支架材料。脱细胞猪角膜基质(Acellular porcine cornea matrix,APCM)具有正常角膜的关键特性,如良好的透明性和生物相容性、与天然角膜相似的力学特性、低免疫原性、可耐受手术缝合等。对于TECs的构建来说,其是一种良好的支架材料。此外,猪角膜来源非常广泛。所以,在本研究中我们拟选用已经脱除了细胞的猪角膜基质(脱细胞猪角膜基质(Porcine cornea matrix,PCM)作为组织工程全厚角膜的支架。以往文献报道APCM在基质囊袋植入术后可维持一年不降解,且角膜基质细胞在移植术后3周可迁入其内。鉴于此,角膜基质细胞在组织工程全厚角膜构建中未接种。但猪角膜的厚度大于人角膜,经脱细胞程序后,其厚度进一步增加,而植片与植床厚度不匹配可影响角膜移植术后切口的愈合。因此,在以脱细胞猪角膜为支架的组织工程全厚角膜的构建中,如何制备与天然角膜厚度相似的脱细胞猪角膜片层是首先需要解决的问题。种子细胞作为构建TECs中的又一关键成分,需要具备来源广泛、可在体外大量扩增等特点。但原代培养的人角膜上皮和内皮细胞增殖能力有限,而经基因转染的角膜细胞系具有潜在的致瘤性,限制了其临床应用。胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)因具有强大的增殖能力和分化全能性,可向机体三个胚层的细胞分化,近年来成为组织工程中种子细胞的一个重要的来源。在我们前期研究中已建立了人胚胎干细胞在体外向角膜缘上皮样细胞和角膜内皮样细胞的诱导分化的方法。诱导的角膜缘上皮样细胞和角膜内皮样细胞与原代培养的细胞具有相似的形态和功能,可作为TECs的种子细胞的来源。角膜的上皮细胞和内皮细胞分别位于角膜前后两面。因此,为了模拟正常角膜结构,建立一个可于支架前后两面同时培养细胞的三维培养方案也是函待解决的问题。综上所述,在本研究中,我们首先开发了一个可制备与天然角膜厚度相似的APCM支架的切割工具。其次,建立了可用于APCM前后两面同时培养细胞的三维培养方案。并通过该培养方案将胚胎干细胞来源的角膜缘上皮样(Limbal epithelial cell-like,LEC-like)细胞和角膜内皮样(Corneal endothelial cell-like)细胞作为种子细胞接种于APCM支架尝试构建组织工程全厚角膜,探讨该培养方案用于构建组织工程全厚角膜的可行性。本研究发现制备的脱细胞猪角膜支架与天然角膜具有相似的厚度和生物力学特性。以其为支架,通过我们建立的三维培养方案构建的组织工程全厚角膜与天然角膜相似,可形成复层的上皮和单层的内皮,且分别表达角膜上皮和角膜内皮细胞标记物。TECs内皮细胞的密度和生物力学特性也与天然角膜相似,并在体内表现出一定的功能。但是该植片的透明度与天然角膜相比仍存在一定的差距,还需要在以后的研究中进一步改进。第一部分APCM支架的制备[目的]探讨使用我们自行设计的APCM切割工具制备的APCM片层是否可用作组织工程全厚角膜的支架。[方法]1.猪角膜脱细胞程序:首先新鲜的猪眼球放置于超净工作台中,使用含1%青霉素与1%链霉素的高温灭菌的PBS充分洗涤。使用角膜穿刺刀和角膜剪取下角膜,中央11mm的角膜使用环钻钻下,然后使用1.5mol/L的无菌氯化钠溶液及5U/ml的DNA/RNA酶处理,脱除猪角膜的细胞成分。2.脱细胞猪角膜片层的切割:将脱完细胞的猪角膜置于我们自行设计的切割工具内,通过加压排出脱细胞猪角膜内的水分,将切割工具的刻度调整至400μm,使用薄刀片沿右侧加压块切割猪角膜基质前板层(如第一部分图2所示),作为组织工程角膜的支架,-20℃无菌保存备用。3.APCM支架的生物学特性检测:HE及DAPI染色检测APCM支架中细胞脱除情况。免疫荧光法检测角膜上皮的基底膜成分collagen Ⅳ和laminin的表达,评价经脱细胞处理的支架的上皮基底膜是否完整。测量样品含水量,使用千分尺测量支架的厚度,分光光度计测量支架的透明度,Instron电子拉伸机测量支架的生物力学强度。[结果]HE和DAPI染色显示APCM支架内未见明显的细胞以及细胞核内物质残留,支架内胶原保存完好,无明显断裂。免疫荧光染色可在APCM支架前表面检测到连续的collagen Ⅳ和laminin表达。APCM支架的厚度和生物力学强度与正常兔角膜相似,含水量略高于正常兔角膜,但透光度略低于正常兔角膜,而经甘油脱水后其透光度增加,甚至略高于正常兔角膜。[结论]高渗盐联合DNA/RNA酶可有效去除猪角膜内的细胞成分,并保留了上皮细胞基底膜。切割后的APCM支架与正常兔角膜厚度和生物力学强度相似,可以用作组织工程全厚角膜构建的支架材料。第二部分hESCs体外分化为LEC-like和CEC-like细胞的实验研究[目的]体外诱导hESCs分化为LEC-like细胞和CEC-like细胞,并分选纯化ABCG2阳性的LEC-like细胞和N-cadherin阳性的CEC-like细胞。[方法]1.hESCs的培养和表型检测:将hESCs H1细胞株培养于Matrigel包被的培养板中,使用mmTeSRl培养基进行培养,每5天传代。免疫荧光法检测hESCs标记物OCT4及SSEA-3的表达。2.人角膜缘上皮细胞和基质成纤维细胞的培养和鉴定:(1)角膜缘上皮细胞(Limbal epithelial cells,LECs)培养:角膜移植术后剩余的角膜环经含1%青霉素-链霉素的PBS充分冲洗后,显微镜下剥除后弹力层,然后置于2.4U/ml的dispase Ⅱ中消化1.5小时,0.25%胰酶-0.02%EDTA消化10分钟,将消化下来的LECs置于2%去生长因子Matrigel包被的培养皿培养。荧光免疫法检测LEC细胞的标记物ABCG2、p63及CK3的表达;(2)角膜基质成纤维细胞(Corneal stromal fibroblasts,CSFs)培养:残余的组织块使用剪刀修剪成约1mm3大小,置于0.02%的胶原酶A中继续消化2小时,离心后接种于培养皿,使用含胎牛血清(FBS)的培养基培养。荧光免疫法检测CSF细胞标记物vimentin和α-SMA的表达。3.条件培养基的收集与配制:(1)LEC细胞条件培养基的配制:根据我们以前研究结果,将收集的LEC细胞培养基与其原培养基以3:1比例混合作为LEC细胞条件培养基;(2)角膜内皮细胞分化培养基的制备:根据我们以前研究结果,晶状体上皮细胞系生长到700%-90%融合时,每12小时收集培养基,与CSF细胞培养基以3:1比例混合作为CEC-like细胞分化培养基。两种条件培养基均经0.22μm滤器过滤除菌后,保存在-80℃冰箱备用。4.体外诱导hESCs分化为LEC-like细胞和CEC-like细胞:(1)hESCs经2mg/ml的dispase酶消化后置于低粘附培养皿中,使用拟胚体(Embryoid bodies,EBs)培养基培养形成EBs。(2)按照我们以往报道的方法诱导hESCs分化为LEC-like和CEC-like细胞。LEC-like细胞的诱导:Ⅳ型胶原包被培养板,24孔板每孔中接种10-15个EBs,使用角膜缘上皮细胞条件培养基培养9天,诱导其分化为LEC-like细胞。CEC-like细胞的诱导:纤连蛋白、层黏连蛋白以及硫酸软骨素包被液包被的六孔细胞培养板,每孔接种80个EBs,通过Transwell与CSF细胞共培养5天,随后去除CSF细胞,使用CEC-like细胞分化培养基继续培养2周,诱导其分化为CEC-like细胞。5.LEC-like细胞和CEC-like细胞的表型鉴定和纯化:(1)LEC-like细胞表型的鉴定和纯化:荧光免疫法检测ABCG2、p63和CK3的表达,流式细胞术分选ABCG2阳性的细胞,作为LEC-like细胞;(2)CEC-like细胞表型鉴定和纯化:免疫荧光法检测N-cadherin、ZO-1和Na+/K+ATP酶的表达,流式细胞术分选N-cadherin阳性的细胞作为CEC-like细胞。[结果]诱导的LEC-like细胞呈铺路石样,高表达ABCG2,p63和CK3,与原代培养的LEC细胞相似。诱导的CEC-like细胞呈多边形,在EBs周围形成内皮细胞单层,CEC细胞标记物N-cadherin、ZO-1和Na+/K+ATP酶荧光免疫染色呈阳性。流式细胞术分析显示诱导的LEC-like细胞中ABCG2阳性的细胞约为34.94%,诱导的CEC-like细胞中N-cadherin阳性的细胞约10.91%。流式细胞术分选的LEC-like 细胞共表达 ABCG2 和 p63,分选的 CEC-like 共表达 N-cadherin、ZO-1和 Na+/K+ ATP 酶。[结论]我们诱导的LEC-like细胞和CEC-like细胞分别与原代培养的角膜缘上皮细胞和角膜内皮细胞表现出相似的形态和标记物表达。通过细胞分选可获取纯度较高的LEC-like细胞和CEC-like细胞。第三部分组织工程全厚角膜的构建和体内功能的检测[目的]探讨使用我们建立的三维培养方案构建组织工程全厚角膜的可行性,并进一步检测构建的组织工程角膜的生物学特性和体内功能,评估其用于穿透性角膜移植(Penetrating keratoplasty,PKP)的可行性。[方法]1.CEC-like细胞和LEC-like细胞的接种:将APCM支架置于我们开发的培养系统的中空插件内(如第三部分图1所示),基质面朝上,将CEC-like细胞按3000/mm2接种于基质面,培养两周。随后反转构建物,使其前弹力层面朝上,然后按照1.5×1 04/mm2的密度接种LEC-like细胞。培养基没过构建物培养1周,随后改为气液界面法继续培养1周,促进上皮形成复层。2.组织工程角膜形态及生物学特性检测:HE染色观察组织工程角膜的组织形态。荧光免疫法检测组织工程角膜上皮及内皮标记物的表达。台盼蓝-茜素红染色,随后于显微镜下计数内皮细胞密度。使用千分尺测量组织工程角膜的厚度,分光光度计测量其的透光度,Instron电子拉伸机测量其生物力学强度。3.穿透性角膜移植:实验组以组织工程全厚角膜作为植片进行PKP手术。对照组:以APCM支架为植片,其余操作与实验组相同。术后行裂隙灯检查、眼压测量以及眼前节OCT检查,观察组织工程角膜植片透明度和厚度变化、角膜新生血管生长及术后免疫排斥反应。术后8周行共聚焦激光角膜显微镜检查观察内皮情况。4.组织学观察:术后1、2、4和8周分别摘除1只家兔角膜,HE染色观察术后组织工程角膜和APCM支架上皮和内皮的变化、基质细胞长入和浸润的炎细胞。抗人核抗体追踪TECs内人角膜细胞在移植术后的变化。免疫荧光法检测移植术后TECs上皮及内皮标记物的表达。[结果]1.组织工程全厚角膜生物学特征的体外检测:HE染色可见构建物形成3-4层上皮和单层的内皮。免疫荧光染色显示:在构建物上皮层中,角膜上皮细胞标记物CK3呈阳性,部分基底部细胞中角膜缘干细胞标记物ABCG2呈阳性,但未检测到p63的表达。构建物内皮中CEC细胞标记物Na+/K+ATP酶、N-cadherin和ZO-1。组织工程角膜与正常兔角膜具有相似的内皮细胞密度、厚度和生物力学强度,但透光度略低于正常兔角膜。2.组织工程全厚角膜体内功能的检测:穿透性角膜移植术后实验组和对照组角膜植片厚度均增加,术后1周后,实验组植片开始变薄,透明度逐渐增加;对照组植片厚度逐渐增加,透明度随时间延长逐渐下降。2-4周时两组中家兔的植片中开始出现新生血管,但在对照组中,新生血管生长更快,至术后8周时新生血管已经长满植片,植片厚度平均为780μm,呈瓷白色,不透明。实验组至术后8周时新生血管长入植片边缘,厚度平均为460μm,透过植片可见虹膜。HE染色示:实验组植片各时间点均可见上皮和内皮细胞覆盖,对照组至术后4周时可见上皮细胞覆盖,但观察期内植片后表面未见内皮细胞。术后2周时两组植片中均可见炎细胞浸润,但在观察期内未见炎细胞明显增加。抗人核抗体染色显示:实验组在4周内可检测到抗人核抗体阳性的上皮细胞。术后8周时在植片上皮中未检测到抗人核抗体阳性的细胞,但在内皮还可以检测到抗人核抗体阳性的细胞,而对照组中没有检测到抗人核抗体阳性的细胞。免疫荧光染色显示:术后4周时,移植的组织工程角膜上皮中可检测到抗人CK3抗体染色阳性的细胞,但未检测到人ABCG2和p63的表达。术后8周时抗人CK3阳性的细胞消失,但在植片内皮面仍可检测到表达人角膜内皮细胞标记物的细胞。[结论]我们建立的三维培养方案可用于组织工程全厚角膜的构建,构建的角膜与天然角膜具有相似的内皮细胞密度、厚度和生物力学强度。在体内,组织工程全厚角膜也表现出一定的天然角膜的生物学功能,且免疫排斥反应并不重,但其透明度仍低于天然角膜。如何提高构建的组织工程全厚角膜在体内的透明度还需要在以后的实验中再进一步研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R779.65;R318.08
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本文编号：1651650