豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞M型胆碱能受体介导的胆碱能抑制机制的研究

发布时间：2018-03-29 19:16

  本文选题：Ⅱ型前庭毛细胞　切入点：乙酰胆碱　出处：《华中科技大学》2012年博士论文

【摘要】：第一部分 豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞存在功能性m2胆碱能受体 目的研究豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上BK电流的胆碱能受体特性。 方法应用全细胞膜片钳技术检测单离豚鼠前庭Ⅱ型毛细胞ACh激活的BK电流对不同胆碱能受体及其亚型的激动剂和拮抗剂的反应特性。 结果①细胞外应用BK通道阻滞剂iberiotoxin (IBTX)200nM可强力阻断ACh激活的外向电流；②细胞外应用传统的N型胆碱能受体拮抗剂美加明(mecamylamine, MLA)和alpha9-N型胆碱能受体拮抗剂士的宁(strychnine)对此电流没有阻断作用；③细胞外应用ml-4亚型M受体拮抗剂,发现此电流对m2型选择性胆碱能受体拮抗剂methoctramine敏感,而对m1型选择性胆碱能受体拮抗剂pirenzepine、m3型选择性胆碱能受体拮抗剂4-DAMP和m4型选择性胆碱能受体拮抗剂tropicamide不敏感；④在同一Ⅱ型毛细胞上,传统的M型胆碱能受体激动剂Carbamyl-β-methylcholine chloride (CCh)和m2型胆碱能受体特异性激动剂Arecaidine propargyl ester (APE)均能激活Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性BK电流,且对m2型选择性胆碱能受体拮抗剂methoctramine敏感,可以被methoctramine强力阻断。 结论Ⅱ型前庭毛细胞BK型胆碱能传出抑制由m2型胆碱能受体介导。 第二部分豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞m2mAChR介导的胆碱能抑制的细胞内信号转导机制 目的研究豚鼠Ⅱ前庭毛细胞m2AChR介导BK型胆碱能抑制的细胞内信号转导机制。 方法应用全细胞膜片钳技术,检测Ⅱ前庭毛细胞ACh敏感性BK电流对细胞内信号转导相关试剂的反应特性。 结果①Ⅱ型前庭毛细胞内透析G蛋白激动剂GTPyS,可以激活ACh-敏感性BK电流,细胞外应用Gi蛋白α亚单位抑制剂GAPnt-2对ACh-敏感性BK电流没有阻断作用,细胞内透析pertussis toxin (PTX)可以明显阻断Ⅱ前庭毛细胞ACh敏感性BK电流,此结果提示Gi蛋白βγ亚单位二聚体在此信号转导中起主要作用；②细胞外应用cAMP膜可渗透性类似物db-cAMP可激活与ACh敏感性BK电流类似的电流,同时ACh敏感性BK电流亦能够被AC特异性阻断剂2,5-dd-Ado明显阻断,提示AC/cAMP参与了该电流的细胞内信号转导。 结论M2型胆碱能受体与细胞内Gi蛋白偶联,通过激活Gi蛋白βγ亚单位二聚体-AC/cAMP-PKA通路介导的钙离子通道蛋白质磷酸化使Ca2-内流,引起BK通道开放,细胞内K+外流,从而导致Ⅱ型前庭毛细胞超级化。
[Abstract]:Part one
The existence of functional M2 cholinergic receptor in guinea pig type II vestibular hair cells
Objective to study the characteristics of the cholinergic receptor on the BK current on the vestibular hair cells of guinea pig type II.
Methods whole cell patch clamp technique was used to detect the ACh activated BK currents in the vestibular type II hair cells of guinea pigs, and their response characteristics to agonists and antagonists of different cholinergic receptors and their subtypes.
The extracellular application of BK channel blocker iberiotoxin (IBTX) 200nM can be effectively blocked the outward current activated by ACh; the extracellular application of N choline can traditional receptor antagonist mecamylamine (mecamylamine, MLA) and type alpha9-N cholinergic receptor antagonist strychnine (strychnine) have no current blocking effect; ML-4 type M receptor antagonist application cell, found that the current sensitive receptor antagonist methoctramine on type M2 cholinergic receptor antagonist, and pirenzepine on M1 selective choline, m3 cholinergic receptor antagonist 4-DAMP and M4 cholinergic receptor antagonist tropicamide is not sensitive to the same; type II hair cells, type M cholinergic receptor agonist Carbamyl- to traditional beta -methylcholine chloride (CCh) and type M2 cholinergic receptor specific agonist of Arecaidine propargyl ester (APE) All of them can activate ACh- sensitive BK currents in type II vestibular hair cells, and are sensitive to M2 type selective cholinergic receptor antagonist methoctramine, and can be blocked by methoctramine.
Conclusion the BK cholinergic efferent inhibition of type II vestibular hair cells is mediated by the M2 cholinergic receptor.
The intracellular signal transduction mechanism of m2mAChR mediated cholinergic inhibition in the second part of guinea pig type II vestibular hair cells
Objective to investigate the intracellular signal transduction mechanism of m2AChR cholinergic inhibition mediated by the vestibular hair cells (vestibule) of guinea pig II.
Methods the whole cell patch clamp technique was used to detect the response characteristics of the ACh sensitive BK current of the vestibular hairy cells to the intracellular signal transduction related reagents.
The results of dialysis G protein in type II vestibular hair cells in the agonist GTPyS, can activate ACh- sensitive BK current, extracellular application of Gi protein alpha subunit inhibitor GAPnt-2 had no blocking effect on ACh- sensitive BK current, intracellular dialysis pertussis toxin (PTX) can obviously block II vestibular hair cells of ACh sensitive BK current, the results suggest that Gi protein beta gamma subunit two poly plays a major role in signal transduction in the body; the extracellular application of cAMP membrane permeable analogue db-cAMP can activate the current similar to ACh sensitive BK current at the same time, the sensitivity of ACh BK current can also be AC specific inhibitor 2,5-dd-Ado inhibited, suggesting that AC/cAMP involved in the current intracellular signal transduction.
Conclusion type M2 cholinergic Gi protein coupled receptors and intracellular calcium ion channel protein phosphorylation through activation of Gi protein beta gamma subunit two dimer -AC/cAMP-PKA pathway mediated the influx of Ca2-, caused by the opening of BK channels in cell K+ outflow, resulting in type II vestibular hair cells of super.

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R764

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本文编号：1682480