上皮—间质转化（EMT）在慢性鼻—鼻窦炎中的作用和机制研究

发布时间：2018-04-10 17:19

  本文选题：慢性鼻-鼻窦炎 + 上皮-间质转化　； 参考：《复旦大学》2012年博士论文

【摘要】：第一部分慢性鼻-鼻窦炎(CRS)患者鼻腔/鼻窦黏膜中的上皮-间质转化(EMT)现象 目的：检测慢性鼻-鼻窦炎(CRS)患者和对照组患者鼻腔/鼻窦黏膜中上皮-间质转化(EMT)相关标志物的表达情况,分析CRS与EMT的关系。 方法：收集2009年9月一2011年2月期间我院耳鼻咽喉科行鼻内镜手术的患者鼻腔/鼻窦黏膜组织标本共39例,其中慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)、慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉(CRSsNP)和非CRS患者各13例,Real-timePCR方法检测α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)、转化生长因子-p1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、E-钙粘附蛋白(E-cadherin)、细胞纤连蛋白(fibronectin)和波形蛋白(vimentin)的mRNA水平。采用Western blot检测上述标志物的蛋白表达水平,以免疫组织荧光方法进行蛋白表达定位。 结果：与非CRS患者相比,CRSsNP患者鼻腔/鼻窦黏膜组织中α-SMA、TGF-β1、 E-cadherin的mRNA相对水平升高(P=0.032；P=0.048；P=0.001),而CRSwNP患者的α-SMA、vimentin的mRNA相对水平下降(P=0.001；P=0.011)；CRSsNP患者的α-SMA、TGF-β1、E-cadherin、MMP-9的蛋白表达升高(P0.001；P0.001；P=0.006；P=0.033=。CRSsNP组和CRSwNP组比较发现,CRSsNP患者的α-SMA、TGF-β1、E-cadherin、fibronectin、vimentin的mRNA相对水平较高(P=0.000；P=0.038；P=0.005；P=0.000；P=0.000),蛋白水平呈现相似的趋势。免疫组织荧光检测证实a-SMA和角蛋白主要表达于鼻腔/鼻窦黏膜组织的上皮层和基底膜。在mRNA水平,a-SMA与TGF-β1、fibronectin、vimentin的表达呈正相关(r=0.443,P=0.005；r=0.596,P=0.000；r=0.501,P0.001)；在蛋白水平,a-SMA与TGF-β1、MMP-9、E-cadherin、fibronectin的表达呈正相关(r=0.918,P=0.000；r=0.415,P=0.009；r=0.395,P=0.013；r=0.486,P=0.002)。 结论：CRSsNP患者鼻腔/鼻窦黏膜组织中a-SMA表达增加,并与TGF-β1、MMP-9、fibronectin表达增强呈正相关,提示EMT可能是CRSsNP的发病机制之一。而在CRSwNP患者,a-SMA的表达较正常下降,提示在CRSwNP患者的鼻腔/鼻窦黏膜组织中可能不存在EMT现象。 第二部分EMT在CRS中的意义及其对鼻内镜手术预后的影响 目的：研究上皮-间质转化(EMT)在CRS中的意义及其对鼻内镜术后CRS预后的影响。 方法：所有入组病例行内镜下鼻窦手术(ESS)。术前收集第一部分中26个CRS患者的临床资料,包括病程,是否伴有过敏性鼻炎、哮喘、阿司匹林过敏、胃食管返流,有无鼻窦手术史,吸烟史等,对患者的CRS症状进行RSOM-31评分；体格检查确定是否伴有鼻息肉；对术前鼻窦CT进行Lund-Mackay评分,进行Lund-Kennedy内镜评分。术后随访26例患者进行症状(RSOM-31评分)和体征(Lund-Kennedy内镜评分),评价预后。统计分析EMT的标志物α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)与术前搜集所得临床数据的相关性,评估EMT在CRS中的意义；分析α-SMA与术后患者症状、内镜评分的相关性评价EMT对CRS患者预后的影响。 结果：除吸烟史(r=-0.402,P=0.042)外,患者是否伴有过敏性鼻炎、哮喘、阿司匹林过敏、胃食管返流以及鼻窦手术史、病程等均不影响EMT的发生,但是血清总IgE呈现与EMT负相关的趋势(r=-0.371,P=0.062)；前组筛窦的CT评分与α-SMA蛋白表达水平呈负相关(r=-0.389,P=0.049)；术前各项症状的评分与α-SMA蛋白表达水平没有明显的相关性；而术后嗅觉下降、听力减退、感觉疲劳、工作能力下降等症状的评分与α-SMA蛋白表达水平呈负相关(r=-0.472,P=0.015；r=-0.413,P=0.036；r=-0.537,P=0.005；r=-0.420,P=0.033)；术前内镜评分总分、术后息肉评分、分泌物评分、内镜评分总分与α-SMA蛋白表达水平呈负相关(r=-0.408,P=0.038；r=-0.439,P=0.025；r=-0.421,P=0.032；r=0.640,P0.001)。 结论：病变涉及其他鼻窦而未涉及前组筛窦的CRS患者可能较容易发生EMT；EMT虽然与术前各种症状不具相关性,但是可能影响患者术后的嗅觉、听力改善以及疲劳、工作能力下降等症状。EMT与内镜评分呈负相关,并影响术后息肉和分泌物等内镜下体征的改变。 第三部分CRS鼻腔/鼻窦黏膜原代上皮细胞体外模型的建立 目的：建立慢性鼻-鼻窦炎(CRS)鼻腔/鼻窦黏膜原代上皮细胞模型。 方法：于内镜下鼻窦手术术中取息肉、中鼻甲或者钩突黏膜组织,过夜消化,分别以差速贴壁+胰酶消化法和免疫磁珠分选法进行细胞培养,分别以免疫荧光标记角蛋白抗体半定量法和流式细胞技术检测两种方法培养的上皮细胞纯度。 结果：免疫荧光定量法检测发现免疫磁珠分选法培养上皮细胞的纯度为89.3%；差速贴壁+胰酶消化法培养的上皮细胞纯度为85.6%；而流式细胞技术检测发现免疫磁珠分选法培养的上皮细胞纯度可以达到92.12%；差速贴壁+胰酶消化法培养的上皮细胞纯度可以达到78.37%；符合上皮-间质转化细胞实验的要求。 结论：差速贴壁+胰酶消化法和免疫磁珠分选法两种细胞纯化、培养方法均可以建立纯度较高的人类鼻腔/鼻窦黏膜原代上皮细胞模型,为进一步的功能学实验奠定了模型基础。 第四部分转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的EMT研究 目的：通过体外实验验证人类鼻腔/鼻窦黏膜上皮细胞可以发生EMT。 方法：采用差速贴壁+胰酶消化法或免疫磁珠分选法培养出纯度较高的上皮细胞,以10ng/ml的TGF-β1诱导上皮细胞发生EMT,用相差显微镜观察细胞形态变化,用免疫荧光双标(α-SMA和角蛋白)检测发生EMT的细胞；以不同浓度(1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml)的TGF-β1诱导上皮细胞,Western blot检测EMT相关标志物α-SMA和E-cadherin的蛋白表达；划痕实验观察TGF-β1诱导后的上皮细胞的迁移能力；Transwell侵袭实验检测TGF-β1诱导后的上皮细胞的侵袭能力。 结果：经TGF-β1诱导后的上皮细胞形态变化明显；免疫荧光双标显示同时标记上皮细胞标志物角蛋白和肌成纤维细胞标志物α-SMA的细胞；Western blot检测发现TGF-β1诱导后的细胞E-cadherin表达下降,α-SMA表达上调；划痕实验发现TGF-β1诱导后的上皮细胞的迁移能力明显升高；Transwell侵袭实验发现TGF-β1诱导后的细胞并未获得侵袭性表型。 结论：在TGF-β1的诱导作用下鼻腔/鼻窦黏膜的原代上皮细胞可以发生EMT,TGF-β1诱导后的上皮细胞转化为肌成纤维细胞,迁移能力增强,体外水平验证EMT可能是CRS的发病机制之一。
[Abstract]:Epithelial - mesenchymal transition ( EMT ) in nasal / nasal mucosa of patients with chronic sinusitis ( CRS ) in the first part

Objective : To detect the expression of epithelial - mesenchymal transition ( EMT ) - related markers in nasal / nasal sinus mucosa of patients with chronic nasal - sinusitis ( CRS ) and control group , and to analyze the relationship between CRS and EMT .

Methods : A total of 39 cases of nasal / nasal sinus mucosal tissue were collected from September 2011 to February 2011 in the nasal / nasal sinus mucosa of our hospital . The mRNA levels of 伪 - smooth muscle actin ( a - SMA ) , transforming growth factor - p1 ( TGF - 尾1 ) , matrix metalloproteinase - 2 ( MMP - 2 ) , matrix metalloproteinase - 9 ( MMP - 9 ) , E - cadherin ( E - cadherin ) , fibronectin ( fibronectin ) and vimentin were detected by Real - time PCR .

Results : Compared with non - CRS patients , the mRNA level of 伪 - SMA , TGF - 尾1 and E - cadherin in nasal / nasal mucosa of patients with CRSsNP was significantly increased ( P = 0.032 ) .
P=0.048锛，

本文编号：1732160