致弱水泡性口炎病毒对恶性黑色素瘤抑制作用的实验研究

发布时间：2018-04-13 19:16

本文选题：溶瘤病毒 + 水泡性口炎病毒　；参考：《浙江大学》2017年博士论文

【摘要】：目的脉络膜黑色素瘤(choroidal melanoma,CM)是成年人最常见的眼内原发性恶性肿瘤,可在肿瘤早期随血行播散,CM一旦发生转移,死亡率极高。传统的治疗方法是眼球摘除术,近几十年出现多种保眼治疗的方法,如放射治疗,局部切除术,经瞳孔温热疗法,激光光凝等;这些新的治疗方法虽然实现了保留眼球、维持部分视功能的作用,但未能明显改善脉络膜黑色素瘤的转移率和生存率。近年来,肿瘤生物治疗成为新兴且疗效显著的肿瘤治疗新模式,其中的溶瘤病毒治疗作为生物疗法之一在多种肿瘤的研究中显示出较好的肿瘤杀伤作用。水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)具有遗传适应性强,病毒拯救体系成熟高效,病毒复制迅速等特点,是肿瘤治疗的良好载体。由于眼部解剖的特殊性,对脉络膜黑色素瘤的治疗需要对眼部健康组织友好的VSV突变株。本研究尝试对野生型水泡性口炎病毒(WT-VSV)进行突变拯救出对神经组织更为安全的致弱型VSV,研究WT-VSV与致弱VSV毒株对体外培养的恶性黑色素瘤细胞特异性杀伤作用及在体内的抗肿瘤作用,并探讨其抗肿瘤作用方式及其相关机制。方法1.拯救实验:利用VSV反向遗传系统和定点突变技术,对野生型VSV的1650与1691位点的氨基酸进行突变成功拯救获得VS V-Y1650A与VS V-F1691A两株致弱水泡性口炎病毒株。2.噬神经性实验:通过VSV滴鼻感染小鼠后进行神经组织的HE及免疫组化检测了解野生型VSV与新拯救的VSV-Y1650A与VSV-F1691A噬神经作用特点。3.体外细胞杀伤实验:使用BHK-21细胞扩增三种VSV病毒,应用TCID50法测定病毒滴度;以体外培养的小鼠黑色素瘤细胞B16细胞为研究对象,通过CCK-8法检测比较不同毒株VSV病毒对B16细胞增殖的影响,并通过流式细胞仪检测不同毒株VSV对B16细胞周期及凋亡的影响。4.体内抑瘤实验:利用小鼠黑色素瘤细胞B16细胞经皮下注射构建裸鼠实体荷瘤模型,瘤体内注射接种VSV-WT与VSV-Y1650A,通过观察肿瘤生长趋势、Western blot法检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白的表达,探讨VSV的体内抑瘤作用效果以及相关的作用机制。结果1.利用单股负链RNA病毒反向基因操作技术,对野生型VSV基因组内L蛋白VI功能域的1650与1691位点的氨基酸进行突变成功拯救获得VSV-Y1650A与VSV-F1691A两株致弱的水泡性口炎病毒突变株。2.WT,Y1650A,F1691A三株VSV分别滴鼻感染小鼠后7天脑部病理切片显示,接种WT-VSV的小鼠脑部出现脑部血管充血,脑实质炎症细胞浸润呈袖套反应等温和的病理变化,而Y1650A和F1691A组小鼠脑部未观察到显著的病理变化。3.体外实验中CCK-8法检测发现WT,Y1650A,F1691A三株VSV均对B16细胞有明显杀伤作用,且杀伤作用存在剂量效应关系。流式细胞仪检测三组VSV病毒作用于B16细胞72h后,与空白组相比,其晚期凋亡细胞的比例均极显著上升(44.44%/WT,28.36%/Y1650A,24.19%/F1691A vs 2.14%,P0.01)。流式细胞周期结果显示,感染病毒的三组均出现G1期细胞数量减少;WT-VSV组(67.96%vs 86.42%,P0.01);Y1650A-VSV组(76.42%vs 86.42%,P0.05);F1691A-VSV组(81.70%vs 86.42%,P0.05);相比,其S期细胞均有明显的上升,感染过VSV的B16细胞有明显的S期阻滞的现象。4.裸鼠荷瘤模型的体内治疗实验结果显示,接种VSV-WT与VSV-Y1650A均可以明显的抑制小鼠体内接种的B16肿瘤的生长,而未见明显的毒副反应。Western blot法检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白结果显示,WT与Y1650A能上调小鼠恶性黑色素瘤组织中的caspase-3,Bax基因的蛋白的表达;同时可以抑制小鼠恶性黑色素瘤组织中CDK-2蛋白的表达。结论1.拯救获得VSV-Y1650A与VSV-F1691A两株致弱的水泡性口炎病毒突变株的噬神经性较WT-VSV明显减弱。2.WT,Y1650A,F1691A三株VSV在体外能够杀伤B16肿瘤细胞,引起细胞凋亡,阻滞细胞周期,在体内实验中能够抑制肿瘤生长,且无明显的毒副反应。3.体外实验的流式细胞凋亡检测及体内实验的凋亡相关蛋白检测均提示VSV杀伤B16细胞的机制与细胞凋亡的途径有关。综上所述,Y1650A-VSV呈现出应用于恶性黑色素瘤治疗的潜力,本研究为脉络膜黑色素瘤溶瘤治疗的进一步研究提供依据。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.7

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