Slit-Robo信号系统对缺氧大鼠神经节细胞影响的相关研究

发布时间：2018-05-11 11:08

本文选题：Robo1 + Robo2　；参考：《吉林大学》2015年博士论文

【摘要】：临床上，视神经损伤可由颅脑外伤、肿瘤压迫、高眼压、炎症等原发病导致，是眼科以及神经外科领域的常见疾病，常导致视力和视野的严重丧失，有的甚至失明，严重影响了患者的生活质量，因此视神经损伤修复的研究已经成为神经眼科学的一个热点。Robo蛋白家族(Roundabout family)包括Robo1，Robo2，Robo3和Robo4等4个成员，是一类与神经发育有一定关联的保守跨膜蛋白家族。Robol，2，3主要在神经系统表达，具有调控神经细胞迁移和神经轴突延伸的作用。2002年，Robo4，亦称MRB(magic roundabout)，被Huminiecki等研究人员率先发现。这一蛋白在内皮细胞表面，尤其是在血管生成活跃的样本中有特异性表达，对抑制病理性新生血管形成，降低内皮细胞通透性有一定作用。Slit蛋白属于分泌性蛋白质，作为配体与Robo蛋白结合发挥作用。通过查阅相关大量文献，对Slit-Robo信号系统在视网膜上的研究多集中于胚胎鼠及出生后21天内的新生鼠，对成年大鼠视网膜是否有Robo蛋白表达及定位，以及在缺氧条件下Slit-Robo信号系统是否发挥保护作用鲜有报导。中枢系统神经中线附近，Slit蛋白的合成主要完成于神经胶质细胞内，也可由神经元自分泌产生。如果在发育过程中Slit不足，在中线附近可观察到由交叉神经元轴突和纵行神经元轴突异常聚集而形成的巨大的神经束。Seeger等研究人员报导，正常发育过程中不应跨过中线的轴突在Robo1突变体中会反复跨越中线。此外，Marillat研究组对Slit2及其受体Robo1，Robo2在大鼠脑内的表达进行了深入研究后发现，Robo家族的表达模式呈高度有序。从原位杂交结果分析，在长距离的投射结构中，这一特点尤为明显。例如，Robo2的表达与发育中的躯体感觉以及视觉、听觉、嗅觉等关系密切。在神经发育的一些关键时期，比如感觉轴突长出向中枢寻路阶段，在中枢中与感觉相关的各个接递站点中，Robo2都有固有表达。据Rajagopala报导，Slit1、2和3在果蝇的神经发育过程中均表达于中线，而Robo1、2和3在这一过程中也在神经元轴突上表达，后者通过与配体Slit结合，从而发挥排斥信号作用。根据Robo1、2、3在轴突上的表达情况，轴突可以分为内侧、中间、外侧三个平行的束：内侧束仅表达Robo1蛋白；中间束表达Robo1和Robo3蛋白；外侧束则表达全部上述三种Robo蛋白。而在病理情况下，上述三种Robo蛋白中任何一种蛋白的突变，都会使所在轴突脱离原本从属的神经束。例如，中间束的轴突中若存在Robo3突变，该轴突就会迁移至偏向内侧束的位置完成发育。此外，在三叉神经轴突的研究中，研究人员发现若以Slit2与轴突进行接触，会促进轴突末端分支的增多，甚至形成网络状结构。另一项研究结果表明，Slitl蛋白对于皮质神经元发育有促进作用，尤其在树突结构的分支化过程以及生长中尤为明显。Wong等在体外实验中切断了坐骨神经，3天后在感觉神经元内测得了Robo2蛋白表达增加。这一增多趋势在7天后达到高峰，并在此水平保持1周左右，直至3～4周后，Robo2的表达水平才恢复正常。依据这些研究结果，Robo2蛋白在神经元受损后表达增加，提示其可能参与到了与感觉突触再生调控有关的过程当中。而在Madura的实验中，面神经核经过轴索显微外科技术横断处理后，从术后第3天起，直至第28天，断端处运动神经元中Robo1和Robo2的mRNA表达量显著持续上升；同时，在横断处理后7-35天期间，肌肉神经发生了再生，提示Robo蛋白家族在轴突修复方面的可能潜能。而在Altay等的研究中，研究者首先成功诱导双侧颈总动脉闭塞，导致大脑弥漫性缺血，而后在Slit的功能分析中发现，Slit能有效减少迟发性神经元死亡，特别对海马区CAI椎体细胞尤为明显。另外Slit可以阻止组织缺氧缺糖后再重新恢复氧合指标及血糖指标这一过程中带来的组织损伤。因此Slit-robo信号系统在胚胎时期中枢神经系统的发育过程中，以及神经元损伤修复过程中起到重要信号调节作用。但是该信号系统在成年大鼠视网膜上表达情况，以及视网膜神经节细胞功能损伤时，是否发挥调节保护作用尚不明确。本研究体内实验部分首先选取Robo1和Robo2蛋白作为检测对象，通过特异性抗体，对正常条件下饲养的成年SD大鼠视网膜进行免疫组化染色发现，Robo1和Robo2蛋白强表达于神经节细胞及神经纤维层，在内核层及光感受器层也有少量表达，恰好与视网膜三级神经元传递信号的特点相符合。为了验证在体内缺氧条件下，Robo1和Robo2蛋白表达变化情况。我们选取健康雄性SD大鼠40只，随机分为正常对照组（CON）20只和糖尿病组（DM）20只。正常对照组（CON）给予普通饲料喂养，自由饮水。糖尿病组（DM）给予配制的高脂颗粒饲料进行高脂饮食喂养6周后，给予STZ单次腹腔注射（35mg/kg，溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH=4.5），制备2型糖尿病模型。STZ注射SD大鼠72小时后，通过尾静脉采血测血糖，DM模型成功标准定为血糖浓度＞16.7mmol/L、尿糖3+～4+，并剔除未达标准的大鼠。建模成功后8周，处死大鼠。利用RT-PCR和Western-blot技术检测STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜中Robo1和Robo2mRNA和蛋白表达变化情况。实时荧光定量PCR结果显示，与正常对照组大鼠相比，糖尿病大鼠视网膜Robo1和Robo2mRNA的表达显著增加，差异具有统计学意义（P㩳0.01）。蛋白免疫印迹结果显示，与正常对照组大鼠相比，糖尿病大鼠视网膜Robo1和Robo2蛋白的表达均显著增加，通过对蛋白表达的灰度分析结果发现，Robo1蛋白表达增加了217.4%， Robo2蛋白的表达增加了470%，差异具有统计学意义（P㩳0.01）。提示在糖尿病视网膜病变早期发生过程中，Robo1和Robo2蛋白可能起到重要调节作用。体外实验部分为了验证体外条件下，缺氧因素对大鼠视网膜神经节细胞表达Robo1和Robo2的影响，我们设计了利用三气培养箱制造缺氧环境，将大鼠RGC-5细胞放入此环境中培养12h，24h，48h后取出，利用RT-PCR和Western-blot技术检测RGC-5细胞mRNA和蛋白表达水平。实时荧光定量PCR结果显示，缺氧条件下RGC-5细胞中Robo1和Robo2mRNA的表达显著增加，，且随着缺氧时间的延长，其表达逐渐增加，差异具有统计学意义（P㩳0.01）。免疫印迹结果进一步显示，缺氧环境下RGC-5细胞中Robo1和Robo2两种蛋白的表达水平会发生改变，随着缺氧时间的延长，两种蛋白表达含量均显著增高，通过对蛋白表达的灰度分析显示，缺氧培养12h，24h，48h后，Robo1蛋白表达量分别增加2.17倍，3.01倍和8.25倍，差异具有统计学意义（P㩳0.01）。Robo2蛋白表达量分别增加了12倍，24倍和47倍，差异具有统计学意义（P㩳0.01）。证明缺氧条件下，RGC-5细胞上Robo1和Robo2蛋白表达会增多。然后为了证明Slit-robo信号系统对成年大鼠视网膜神经节细胞的保护作用，我们设计了利用RNA干扰靶向干涉RGC-5细胞中的Slit2、Robo1、Robo2，应用实时荧光定量PCR和Western blot法检测靶向干涉效率，同时利用免疫荧光染色检测转染后的RGC-5后细胞凋亡形态变化，以及利用Annexin-V FITC/PI双染法检测RGC-5细胞的凋亡率。结果如下：DAPI染色显示，与对照组相比，分别抑制Robo1，Robo2和Slit2表达后，RGC-5细胞核出现染色体固缩，部分细胞核呈颗粒状等典型细胞凋亡形态。Annexin V FITC/PI流式细胞术检测显示，与对照组相比，抑制Robo1，Robo2和Slit2表达后，RGC-5细胞凋亡数量明显显著增多，由3.9%增加到28.48%、25.89%和20.62%。证明Slit-robo信号可以抑制成年大鼠神经节细胞凋亡，从而发挥保护作用。综上所述，本实验体内部分证明Robo1和Robo2蛋白主要存在于大鼠视网膜中神经节细胞及神经纤维层。II型糖尿病大鼠视网膜中Robo1和Robo2蛋白表达增多。体外缺氧条件下大鼠RGC-5细胞中的Robo1和Robo2表达增多，随着缺氧时间的增加，蛋白表达量增加。siRNA干扰Slit-Robo信号通路蛋白的表达能够增加体外培养大鼠视网膜神经节细胞凋亡率，Slit-Robo信号系统对视网膜神经节细胞起到保护作用。但Slit-robo信号系统具体如何发挥保护作用机制尚不清楚。
[Abstract]:In 2002 , Robo4 , Robo2 , Robo3 and Robo4 play a role in inhibiting pathological neovascularization and decreasing the permeability of endothelial cells .

According to Rajagopala , Slit2 and its receptor Robo1 and Robo2 were expressed in the middle line .
the middle beam expresses Robo1 and Robo3 protein ;
In the study of trigeminal neurites , the expression level of Robo2 protein increased after 7 days , and the expression level of Robo2 increased after 3 - 4 weeks .
At the same time , during 7 - 35 days after transection , the muscle nerve regeneration , suggesting the potential of the Robo protein family in axonal repair . In Altay et al . , the researchers first succeeded in inducing bilateral common carotid artery occlusion , leading to diffuse ischemia in the brain .

In order to verify the expression of Robo1 and Robo2 protein in diabetic rats , the levels of Robo1 and Robo2 in diabetic rats were significantly increased compared with normal control rats .

The expression levels of Robo1 and Robo2 in RGC - 5 cells were significantly increased by RT - PCR and Western - blot . The expression levels of Robo1 and Robo2 in RGC - 5 cells increased by 2 . 17 - fold , 3 . 01 - fold and 8 . 25 - fold respectively .

In order to demonstrate the protective effect on retinal ganglion cells of adult rats , we designed the expression of Slit2 , Robo1 , Robo2 in RGC - 5 cells by using RNA interference . The results showed that the apoptosis of RGC - 5 cells was significantly increased after the expression of Robo1 , Robo2 and Slit2 by immunofluorescence staining . The results showed that the number of apoptotic cells in RGC - 5 cells increased significantly from 3.9 % to 28.48 % , 25.89 % and 20.62 % respectively .

In conclusion , Robo1 and Robo2 proteins were mainly present in retinal ganglion cells and nerve fiber layers in rat retina . Robo1 and Robo2 expression increased in the retina of type II diabetic rats . The expression of Robo1 and Robo2 increased in rat RGC - 5 cells in vitro . The expression of Robo1 and Robo2 increased with the increase of hypoxia time .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.6

【参考文献】