先天性小耳畸形长链非编码RNA和信使RNA的差异表达分析及调控关系的研究

发布时间：2018-05-23 06:43

  本文选题：小耳畸形 + 生物信息学分析　； 参考：《北京协和医学院》2016年博士论文

【摘要】：目的：通过对先天性小耳畸形患者的残耳软骨与对侧正常耳廓软骨组织进行基因芯片的检测,筛选出小耳畸形相关差异表达的LncRNAs和mRNAs,根据生物信息学分析KEGG通路、GO分析等方法对差异表达的mRNAs进行功能注释和分析。进一步筛选出可能与小耳畸形相关的LncRNAs和mRNAs,并通过qRT-PCR和Western blotting的方法进一步进行验证,为今后深入研究先天性小耳畸形的分子机制及其防治提供科学依据。方法：样本均源于中国医学科学院整形外科医院收治的单侧非综合征型先天性小耳畸形患者。患耳及正常耳组织均无感染及软骨炎等征象。样本均来源于耳再造三期手术中的废弃组织,每侧各约100mg,其中正常侧耳廓软骨组织取自术中为矫正双侧颅耳角不对称所废弃的部分。本实验以残耳软骨组织为实验组,正常耳软骨组织为对照组。通过Array star Human LncRNA Microarray V3.0筛选单侧先天性小耳畸形患者差异表达的LncRNAs和mRNAs.通过KEGG生物学通路分析、GO分析等对差异表达的LncRNAs和mRNAs进行功能注释和预测,并采用CNC共表达网络关系图对重点的LncRNAs进行编码-非编码基因共表达网络的构建。根据生物信息学分析选择LncRNA-NR_028308、 LncRNA-uc003jsd.1及LPL、TNFRSF11B和LncRNA-ENST00000449766及其邻近编码蛋白基因Zinc Finger Protein 36-Like 2 (ZFP36L2)两组基因,通过实时定量聚合酶链反应和Western blotting的方法进一步验证其表达情况。结果：本实验所用的基因芯片包含30586个lncRNAs和26109个mRNAs探针；与正常侧软骨比较,残耳软骨共检测出差异性表达LncRNAs共有180条,其中表达上调的LncRNAs有74条,表达下调的LncRNAs有106条。差异表达的mRNAs共有515条,其中表达上调的mRNAs有101条,表达下调的mRNAs有414条。信号通路分析显示上调通路有5条,下调通路有27条,涉及到甘油酯类代谢、破骨细胞分化、肿瘤生长等通路。在GO分析中,我们的结果中上调基因中涉及生物过程的基因有321条,涉及细胞组件的基因有16条,以及分子功能的基因有41条。下调基因中涉及生物过程的基因共有553条,涉及细胞组件的基因有101条,以及分子功能的基因有74条。同时选择了15个LncRNAs和120个mRNAs构建了CNC共表达网络。我们对所选择的LncRNA-NR_028308、 LncRNA-uc003jsd.1及LPL、TNFRSF11B和LncRNA-ENST00000449766及ZFP36L2两组基因,通过实时定量聚合酶链反应和Western blotting的方法进一步验证其表达情况。与对照组验证结果显示,qRT-PCR方法验证的两组LncRNAs和mRNAs基因表达均上调,P值小于0.05,与芯片结果一致。用Western blotting法检测差异表达基因蛋白水平的表达,结果显示与对照组相比,实验组软骨组织中与对照组相比LPL、TNFRSF11B和ZFP36L2基因表达上调。结论：先天性小耳畸形在相同遗传背景下残耳软骨与正常耳廓软骨组织之间lncRNAs和mRNAs的表达存在明显的差异,这些lncRNAs及mRNAs可能通过某些信号通路在小耳畸形发生和发展中发挥重要作用。LncRNA-NR_028308、 LncRNA-uc003jsd.1及LPL、 TNFRSF11B和LncRNA-ENST00000449766及ZFP36L2在先天性小耳畸形中参与的生物过程、信号通路等可能与先天性小耳畸形的发病有关。
[Abstract]:Objective: to screen the differentially expressed LncRNAs and mRNAs of the small ear malformation by detecting the gene chip of the residual ear cartilage and the contralateral normal auricle cartilage tissue in the patients with congenital microtia. The functional annotation and analysis of the differentially expressed mRNAs were carried out according to the bioinformatics analysis of KEGG pathway and GO analysis. LncRNAs and mRNAs, which may be associated with the microtia, were selected and verified by qRT-PCR and Western blotting, and the scientific basis for the further study of the molecular mechanism and prevention of congenital microtia was provided. There were no signs of infection and cartilage inflammation in the patients with congenital microtia. All the samples were derived from the discarded tissues in the three stages of the reconstruction of the ear. Each side was about 100mg. The normal lateral auricular cartilage tissue was taken from the operation to correct the discarded parts of the bilateral cranial angle. The experiment was conducted with the cartilage tissue of the residual ear. Group, normal ear cartilage tissue was the control group. Through Array star Human LncRNA Microarray V3.0 screening the differential expression of unilateral congenital microtia patients, LncRNAs and mRNAs. were analyzed by KEGG biological pathway, GO analysis and other expressions of LncRNAs and mRNAs were annotated and predicted. Dot LncRNAs carries out the construction of coencoded non coding gene co expression network. According to bioinformatics analysis, LncRNA-NR_028308, LncRNA-uc003jsd.1 and LPL, TNFRSF11B and LncRNA-ENST00000449766 and the adjacent coding protein gene Zinc Finger Protein 36-Like 2 (ZFP36L2) two genes are selected by real time quantitative polymerase chain reaction and Wes. Tern blotting method further verified its expression. Results: the gene chip used in this experiment contains 30586 lncRNAs and 26109 mRNAs probes. Compared with the normal lateral cartilage, there are 180 items of LncRNAs in the residual ear cartilage, of which there are 74 up-regulated LncRNAs and 106 down regulated LncRNAs. There were 515 expressions of mRNAs, of which 101 were up-regulated and 414 down regulated mRNAs. Signal pathway analysis showed that there were 5 up-regulated pathways and 27 down regulated pathways involved in the pathway of glycerol ester metabolism, osteoclast differentiation, tumor growth and so on. In GO analysis, our results up-regulated the basis for biological processes involved in the gene. There were 321 genes involved in cell components, 16 genes and 41 molecular functions. There were 553 genes involved in the biological processes, 101 genes involved in cell components, and 74 molecular functions, and 15 LncRNAs and 120 mRNAs were selected to construct a CNC co expression network. Two genes of LncRNA-NR_028308, LncRNA-uc003jsd.1 and LPL, TNFRSF11B and LncRNA-ENST00000449766 and ZFP36L2 were further verified by real-time quantitative polymerase chain reaction and Western blotting. The results showed that the expression of the two groups of LncRNAs and mRNAs genes in the qRT-PCR method proved up up. The Western blotting method was used to detect the expression of differentially expressed gene protein levels by Western blotting. The results showed that compared with the control group, the experimental group was up to LPL, TNFRSF11B and ZFP36L2 gene expression in the cartilage tissue compared with the control group. Conclusion: the congenital auricular malformation in the same genetic background and normal ear under the same genetic background. There are obvious differences in the expression of lncRNAs and mRNAs among the cartilage tissue. These lncRNAs and mRNAs may play an important role in the occurrence and development of small ear deformities through some signaling pathways,.LncRNA-NR_028308, LncRNA-uc003jsd.1 and LPL, TNFRSF11B and LncRNA-ENST00000449766 and ZFP36L2 in congenital microtia. Process and signal pathway may be related to the pathogenesis of congenital microtia.
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R764.7

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本文编号：1923677