GPR91调控MAPK通路在糖尿病性视网膜病史中的作用

发布时间：2018-06-05 15:01

  本文选题：糖尿病性视网膜病变(DR) + G蛋白偶联受体91(GPR91)　； 参考：《上海交通大学》2015年博士论文

【摘要】：目的:糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病患者最严重的微血管并发症之一,目前发病机制尚未明确。通过模拟糖尿病的体内外环境,观察G蛋白偶联受体91(GPR91)对DR微血管病理改变的影响;探讨GPR91通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路调控VEGF的分子机制。方法:构建GPR91小发夹RNA(sh RNA)慢病毒载体及相应的空病毒。(1)体内实验:健康雄性SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素制备糖尿病模型。成模2W时玻璃体腔注射GPR91 sh RNA慢病毒。气相色谱质谱联用仪检测视网膜中琥珀酸含量。注射病毒后12W,HE染色,透射电镜和依文思蓝渗漏实验观察视网膜微血管的结构及功能改变。(2)体外实验:高糖/琥珀酸/低氧孵育的RGC-5细胞和原代视网膜神经节细胞转染GPR91 sh RNA或si RNA,Western blot检测GPR91,p-ERK1/2,p-JNK,p-p38 MAPK,COX-2,C/EBPβ,C/EBPδ,c-Fos和VEGF的表达情况;免疫荧光检测GPR91,C/EBPβ,C/EBPδ和c-Fos的胞内定位情况;RT-PCR检测GPR91,COX-2,C/EBPβ,C/EBPδ,c-Fos和VEGF的m RNA表达;ELISA检测PGE2和VEGF的分泌情况;RGC-5与RF/6A细胞共培养检测RF/6A细胞的增殖迁移能力;荧光素酶报告系统(Luciferase)和染色质免疫共沉淀(Ch IP)检测C/EBP、AP1调控VEGF的转录情况。结果:成功构建GPR91 shRNA慢病毒载体。(1)体内实验:糖尿病大鼠视网膜中琥珀酸含量较对照组增加(P0.01),GPR91的表达并未出现明显差异。GPR91sh RNA玻璃体腔注射可改善糖尿病大鼠视网膜微血管结构和功能的破坏。(2)体外实验:RGC-5细胞和原代神经节细胞经高糖/琥珀酸/低氧孵育,p-MAPK,COX-2,PGE2,C/EBPβ,C/EBPδ,c-Fos和VEGF表达均增加(P0.01)。转染GPR91 sh RNA或si RNA后p-ERK,p-JNK,COX-2,PGE2,C/EBPβ,C/EBPδ,c-Fos和VEGF表达下调。ERK1/2抑制剂预处理后COX-2,PGE2,C/EBPβ,C/EBPδ,c-Fos和VEGF表达下调。COX-2抑制剂预处理后PGE2和VEGF表达下调;转染GPR91 sh RNA后抑制共培养的RF/6A细胞增殖迁移能力(P0.01)。C/EBPβsi RNA转染细胞后VEGF表达下调;Luciferase和Ch IP结果显示C/EBPβ调节VEGF的转录过程。结论:早期糖尿病大鼠视网膜中琥珀酸蓄积;玻璃体腔注射GPR91 sh RNA可改善视网膜微血管病变。GPR91通过ERK1/2/COX-2/PGE2通路调控VEGF的分泌进而调控高糖/琥珀酸孵育下内皮细胞的血管生成能力;GPR91可通过ERK1/2/CEB/Pβ通路调控缺氧条件下原代神经节细胞的VEGF转录。
[Abstract]:Objective: diabetic retinopathy (DRN) is one of the most serious microvascular complications in diabetic patients. The effects of GPR91 on the pathological changes of Dr microvessels were observed by simulating the in vivo and in vivo environment of diabetes mellitus, and the molecular mechanism of GPR91 regulating VEGF through mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway was investigated. Methods: to construct GPR91 small hairpin RNA-RNA lentivirus vector and the corresponding empty virus. In vivo experiment: healthy male Sprague-Dawley rats were injected intraperitoneally with streptozotocin to make diabetic model. GPR91 sh RNA lentivirus was injected into vitreous cavity at 2 W. The content of succinic acid in retina was determined by gas chromatography-mass spectrometry. After the injection of the virus, he stained with 12W, Transmission electron microscopy and Evans blue leakage assay to observe the changes of structure and function of retinal microvessels in vitro: high glucose / succinic acid / hypoxia incubated RGC-5 cells and primary retinal ganglion cells transfected with GPR91 sh RNA or si RNAs Western blot The expression of c-Fos and VEGF in the C / EBP 尾 -C / EBP 未 -C / EBP 未 -c-Fos and VEGF were detected. The intracellular localization of C- / EBP 尾 -C / EBP 未 and c-Fos were detected by immunofluorescence. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of C / EBP 尾 -C / EBP 未 -c-Fos and VEGF. The secretion of PGE2 and VEGF was detected by Elisa. The proliferation and migration of RF6A cells were detected by co-culture of RGC-5 and RF-6A cells. Luciferase reporting system (Luciferase) and chromatin immunoprecipitation (Ch IP) were used to detect the transcription of VEGF regulated by C / EBP PnAP1. Results: the successful construction of GPR91 shRNA lentivirus vector in vivo: the content of succinic acid in the retina of diabetic rats was increased compared with the control group. There was no significant difference in the expression of GPR91. GPR91sh RNA intravitreal injection could improve the visual reticulum of diabetic rats. The damage of membrane microvessel structure and function. (2) in vitro, the expression of c-Fos and VEGF were increased in 10% RGC-5 cells and primary ganglion cells incubated with high glucose / succinic acid / hypooxic acid / PGE2PGE2C / EBP 尾 -C / EBP 未 -c-Fos and VEGF. After transfection of GPR91 sh RNA or si RNA, the expression of PGE2, c-Fos and VEGF were down-regulated after transfection of GPR91 sh RNA or si RNA, and the expression of PGE2 and VEGF were down-regulated after pretreatment with COX-2 inhibitor. The expression of PGE2 and VEGF were down-regulated after pretreatment with COX-2 inhibitor. After transfection of GPR91 sh RNA, the proliferation and migration ability of co-cultured RFR / 6A cells was inhibited and the expression of VEGF was down-regulated after transfection of C- / EBP 尾 -si RNA. The results showed that C / EBP 尾 regulated the transcription process of VEGF. Conclusion: succinic acid accumulates in retina of early diabetic rats. Injection of GPR91 sh RNA into vitreous body can improve retinal microangiopathy. GPR91 regulates the secretion of VEGF through ERK1 / 2 / COX-2 / PGE2 pathway, and then regulates the angiogenesis of endothelial cells incubated with high glucose / succinic acid. GPR91 can regulate the angiogenesis of endothelial cells under hypoxia through ERK1 / 2 / CEB- P 尾 pathway. VEGF transcription in primary ganglion cells.
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R774.1

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本文编号：1982393