大黄素乙酰化产物B对鼻咽癌细胞放射增敏的线粒体蛋白靶点研究

发布时间：2018-06-06 11:52

  本文选题：大黄素乙酰化产物B + 放射增敏　； 参考：《广西医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的：研究大黄素乙酰化产物B放射增敏过程中对鼻咽癌CNE-1细胞的线粒体功能的影响,应用基于二维液相色谱/质谱联用的稳定同位素标记(iTRAQ-2D-LC/MALDI-TOF/TOF/MS)的方法分析放射增敏前后线粒体的蛋白质差异,初步确定大黄素乙酰化产物B放射增敏作用的线粒体蛋白靶点。 方法：(1)透射电镜观察大黄素乙酰化产物B对鼻咽癌CNE-1细胞放射增敏过程中线粒体超微结构的改变；(2)罗丹明123染色结合激光共聚焦显微镜测定大黄素乙酰化产物B对CNE-1细胞放射增敏过程中线粒体跨膜电位的变化；(3)Fluo-3AM染色结合激光共聚焦显微镜测定大黄素乙酰化产物B对CNE-1细胞放射增敏过程中细胞内钙离子浓度的变化；(4)采用线粒体蛋白提取试剂盒提取鼻咽癌CNE-1细胞线粒体蛋白；(5)采用iTRAQ-2D-LC/MALDI-TOF/TOF/MS方法定量分析大黄素乙酰化产物B对鼻咽癌CNE-1细胞放射增敏前后细胞的线粒体蛋白质组,ProteinPilot2.0对NCBInr数据库进行检索鉴定蛋白,报告置信度在95%以上的蛋白质；(6)通过gene ontology、David、NCBI等数据库分析差异蛋白的细胞定位、分子功能和生物过程,并应用string数据库对差异表达蛋白质进行相互作用网络分析,初步确定大黄素乙酰化产物B放射增敏作用的线粒体节点蛋白。 结果： (1)透射电镜结果显示,空白对照组细胞形态正常,细胞器结构完整丰富,线粒体内膜清晰呈现；2Gy照射组和10μ g/ml大黄素乙酰化产物B作用组,细胞的超微结构变化不明显；而10μg/ml大黄素乙酰化产物B联合放射增敏组可以观察到细胞膨胀、体积增大、细胞内线粒体肿胀、脊断裂等改变。 (2)空白对照组细胞罗丹明123染色后荧光强度均值为40.63±2.36,2Gy照射组和10μg/ml大黄素乙酰化产物B作用组荧光强度均下降,荧光强度值分别为36.73±2.62和26.56±1.29,与空白对照组比较差异有统计学意义(P0.05),10μ/ml大黄素乙酰化产物B联合放射增敏组荧光强度值最低,为19.14±3.84,与2Gy照射组和10μ g/ml大黄素乙酰化产物B作用组比较差异有统计学意义(P0.05),与空白对照组比较差异有明显的统计学意义(P0.01)。(3)空白对照组细胞Fluo-3AM染色后荧光强度均值为1164.17+68.69,2Gy照射组和10μg/ml大黄素乙酰化产物B作用组荧光强度均上升,荧光强度值分别为1391.83±33.35和1406.0±48.02,与空白对照组比较差异有统计学意义(P0.05),10μ g/ml大黄素乙酰化产物B联合放射增敏组荧光强度值最高,为1940.08±55.74,与2Gy照射组和10μ g/ml大黄素乙酰化产物B作用组比较差异有统计学意义(P0.05),与空白对照组比较差异有明显的统计学意义(P0.01)。(4)提取所得线粒体,经詹纳斯绿B染色呈现蓝绿色的颗粒状或线状结构；BCA法测定线粒体蛋白浓度,标准曲线相关系数r=0.99,空白组,2Gy照射组、10μ g/ml大黄素乙酰化产物B作用组和10μ g/ml大黄素乙酰化产物B联合放射增敏组4组细胞线粒体蛋白浓度分别为：2.07,2.10,1.93和2.07μg/μL (5)采用iTRAQ-2D-LC/MALDI-TOF/TOF/MS方法分析增敏过程中各组线粒体蛋白质组,共鉴定出线粒体相关蛋白998个(置信度95%),分子量范围在555.62KD～6.92KD之间。 (6)对所鉴定蛋白进行差异分类,与空白对照组比较,各组线粒体蛋白表达量均有显著性差异(≥1.5fold)的蛋白有101种,其中与创伤、应激反应相关的蛋白最多占19.8%。差异表达蛋白质相互作用网络分析结果表明差异蛋白质HspA8、Cox7C、ATP5A1等是大黄素乙酰化产物B放射增敏作用的节点蛋白。结论： (1)经10μg/ml大黄素乙酰化产物B联合2Gy照射对鼻咽癌CNE-1细胞的放射增敏作用,与细胞内线粒体损伤,线粒体跨膜电位下降,细胞内钙超载等密切相关。 (2)采用iTRAQ-2D-LC/MALDI-TOF/TOF/MS的方法成功的鉴定大黄素乙酰化产物B对鼻咽癌CNE-1细胞放射增敏线粒体相关差异蛋白101种,这些蛋白主要涉及应激反应和氧化还原反应过程。 (3)对差异蛋白进行分类及生物信息学分析,节点蛋白HspA8、Cox7C、ATP5A1等有望成为大黄素乙酰化产物B放射增敏作用的蛋白靶点。
[Abstract]:Objective: To study the effect of emodin acetylation product (B) on mitochondrial function of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells during radiosensitization of nasopharyngeal carcinoma (nasopharyngeal carcinoma), and to analyze the protein difference of the grain body before and after radiosensitization by two-dimensional liquid chromatography / mass spectrometry (iTRAQ-2D-LC/MALDI-TOF/TOF/MS), and to determine the acetyl of emodin The mitochondrial protein target of radiosensitization of the product B.
Methods: (1) the ultrastructural changes of mitochondria were observed by emodin acetylation product B during radiosensitization of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells. (2) Luo Danming 123 staining and laser confocal microscopy were used to determine the changes of mitochondrial transmembrane potential during radiosensitization of CNE-1 cells by the acetylation of emodin product B; (3) Fluo-3AM staining The changes in intracellular calcium concentration of emodin acetylation product B during radiosensitization of CNE-1 cells were measured by laser confocal microscopy. (4) mitochondrial protein extraction kit was used to extract mitochondrial protein from CNE-1 cells of nasopharyngeal carcinoma; (5) iTRAQ-2D-LC/MALDI-TOF/ TOF/MS method was used to quantitatively analyze the B pairs of emodin acetylation products. The mitochondrial protein group of CNE-1 cells before and after radiosensitization of nasopharyngeal carcinoma cells, ProteinPilot2.0 to retrieve and identify the protein of NCBInr database, report the protein with confidence of more than 95%; (6) analyze the cell location, molecular function and biological process of differential protein by gene ontology, David, NCBI and so on, and apply string data. Based on the interaction network analysis of differentially expressed proteins, the mitochondrial node protein of radiosensitization of emodin acetylated product B was preliminarily determined.
Result锛，

本文编号：1986427