自噬抑制剂3-MA增强内质网应激诱导的人鼻咽癌细胞的凋亡

发布时间：2018-06-17 02:10

本文选题：鼻咽癌 + 顺铂　；参考：《蚌埠医学院》2012年硕士论文

【摘要】：目的： 1.观察顺铂（cisplatin，DDP）或电离辐射（ionizing radiation，IR）对人鼻咽癌细胞增殖抑制及诱导凋亡作用，以及DDP、IR能否诱导人鼻咽癌细胞产生内质网应激、自噬。 2.观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）对人鼻咽癌细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用，以及对人鼻咽癌细胞放化疗的增殖抑制及诱导凋亡作用和自噬相关蛋白表达的影响。 3.观察内质网应激诱导剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG）、衣霉素（tunicamycin，TM）对人鼻咽癌细胞增殖抑制的影响，以及自噬抑制剂3-MA对2-DG、TM诱导的人鼻咽癌细胞凋亡及自噬相关蛋白表达的影响。方法： 1. MTT法检测DDP（0.06、0.60、6.00、60.0、600μmol·L~(-1)）、IR（2、4、6、8、10Gy）处理人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-224、36、48h后对细胞存活率的影响；Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测DDP（6.00μmol·L~(-1)）、IR（4Gy）对人鼻咽癌细胞诱导凋亡的作用；Western blotting法检测DDP（6.00μmol·L~(-1)）、IR（4Gy）处理人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-26、16、24h后对人鼻咽癌细胞中内质网应激相关蛋白GRP78、自噬相关蛋白beclin1和LC3表达的影响。 2. MTT法检测自噬抑制剂3-MA（0.625、1.25、2.5、5、10mmol·L~(-1)）对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2存活率的影响；采用MTT法和集落克隆形成法检测了自噬抑制剂3-MA对DDP、IR刺激人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用的影响；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、DAPI染色荧光显微镜观察自噬抑制剂3-MA（1mmol·L~(-1)）对DDP（6.00μmol·L~(-1)）、IR（4Gy）诱导的人鼻咽癌细胞凋亡的影响；同上处理，Western blotting法检测自噬抑制剂3-MA对DDP、IR诱导的人鼻咽癌细胞中自噬相关蛋白beclin1和LC3表达的影响；Immunocytochemistry法检测自噬抑制剂3-MA对DDP、IR诱导的人鼻咽癌细胞中自噬相关蛋白beclin1表达的影响。 3. MTT法检测内质网应激诱导剂2-DG（1.25、2.5、5、10、20mmol·L~(-1)）、TM（2、 4、8、16、32μmol·L~(-1)）对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2存活率的影响；采用MTT法和集落克隆形成法检测了自噬抑制剂3-MA对2-DG、TM刺激人鼻咽癌细胞增殖抑制作用的影响；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、DAPI染色荧光显微镜检测自噬抑制剂3-MA对2-DG（5mmol·L~(-1)）、TM（1μmol·L~(-1)）诱导的人鼻咽癌细胞凋亡的影响；同上处理，Western blotting法检测自噬抑制剂3-MA对2-DG、TM刺激的人鼻咽癌细胞中自噬相关蛋白beclin1和LC3表达的影响；Immunocytochemistry法荧光显微镜检测自噬抑制剂3-MA对2-DG、TM诱导的人鼻咽癌细胞中自噬相关蛋白beclin1表达的影响。结果：一、DDP、IR对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2增殖及凋亡的影响 1．MTT法结果显示不同浓度的DDP、不同剂量的IR对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2均具有增殖抑制作用，且随着DDP浓度的增加和作用时间的延长，DDP对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用增强，6.00μmol·L~(-1)DDP作用于人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2的24、36、48h存活率分别为80.74%、79.95%、78.92%和82.15%、82.05%、79.13%；随着IR剂量的增加和作用时间的延长，IR对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用也逐渐增强，4Gy IR作用于人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-224、36、48h后细胞存活率分别为82.29%、73.51%、62.35%和92.35%、83.58%、72.37%。 2．6.00μmol·L~(-1)DDP刺激人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-224h后，诱导人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2的凋亡率分别为5.8%和6.7%，与阴性对照组比较无统计学意义，4Gy IR作用24h诱导的人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2的凋亡率分别为5.1%和5.4%，与阴性对照组比较无统计学意义。 3．经6.00μmol·L~(-1) DDP、4Gy IR处理人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-26、16、24h后，人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2内质网应激反应的标志蛋白GRP78呈时间依赖性上调，自6h起逐渐升高，24h达到高峰。Western blotting法进一步检测了放化疗后自噬的标志蛋白beclin1、LC3的变化，结果显示放化疗后人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2自噬标志蛋白beclin1呈时间依赖性上调，自噬相关蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化。二、3-MA联合DDP、IR对人鼻咽癌细胞增殖抑制及诱导凋亡和自噬相关蛋白beclin1、LC3表达的影响 1．MTT法检测结果显示：CNE-1、CNE-2细胞经不同浓度3-MA处理后，出现细胞增殖抑制作用，并且随着3-MA浓度的增加和作用时间的延长，3-MA对细胞的增殖抑制作用逐渐增加。在3-MA作用于人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2的剂量中，0.625mmol·L~(-1)无明显细胞死亡，为非抑制浓度。 6.00μmol·L~(-1)DDP、4Gy IR、1mmol·L~(-1)3-MA以及合用组作用不同时间（24、36、48h）对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2具有增殖抑制作用。结果显示，DDP、IR与3-MA合用组人鼻咽癌细胞存活率明显降低，均低于单用组，与阴性对照组比较均有统计学意义（P0.05）。使用0.1mmol·L~(-1)3-MA和（或）0.60μmol·L~(-1)DDP、0.4Gy IR刺激细胞，集落克隆形成实验进一步检测DDP、IR对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用的影响。结果表明：DDP、IR、3-MA在低剂量（或浓度）时即可明显抑制CNE-1、CNE-2细胞的集落克隆形成，3-MA可增强DDP、IR的抑制作用。 2．实验中采用6.00μmol·L~(-1)DDP、4Gy IR、1mmol·L~(-1)3-MA以及合用组处理人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-224h，，线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测结果显示：阳性对照药CCCP（50μmol·L~(-1)）处理细胞20min，与阴性对照组比较细胞的红色荧光向绿色荧光转变比较明显，单用组没有观察到红色荧光向绿色荧光转变，合用组红色荧光向绿色荧光转变也比较明显；DAPI染色荧光显微镜观察细胞核形态学的变化，合用组人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞表现为细胞核皱缩浓集而呈亮蓝色荧光，或核呈分叶，碎片状；而在阴性对照组中及单独处理组中未发现异常形态的细胞核表现，可见细胞核轮廓清晰圆滑，发出淡蓝色荧光，结构均一。 3．Western blotting法检测自噬相关蛋白beclin1、LC3的变化，结果显示：阴性对照组人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2中，自噬反应处于较低水平，自噬相关蛋白beclin1表达较多，自噬相关蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化；而经过DDP或IR处理组出现较强的自噬反应，自噬相关蛋白beclin1较对照组高，自噬相关蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化明显减少。3-MA与DDP、IR联合处理组自噬相关蛋白beclin1表达明显降低，自噬相关蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化与DDP、IR组比较明显减少。Immunocytochemistry法进一步观察了自噬相关蛋白beclin1表达，与Westernblotting结果一致。三、3-MA联合2-DG、TM对人鼻咽癌细胞增殖抑制及诱导凋亡和自噬相关蛋白beclin1、LC3表达的影响 1．MTT法结果显示随着2-DG浓度的增加和作用时间的延长，2-DG对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用增强，5mmol·L~(-1)2-DG作用于人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2后24、36、48h存活率分别为72.13%、53.14%、47.99%和69.32%、68.02%、67.02%。2μmol·L~(-1)TM作用于人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2的24、48、72h存活率分别为72.43%、69.05%、65.13%和93.28%、91.58%、79.21%。 MTT法检测了5mmol·L~(-1)2-DG、1μmol·L~(-1)TM、1mmol·L~(-1)3-MA以及2-DG、TM与3-MA合用组作用不同时间（24、36、48h）对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2的增殖抑制作用。结果显示，2-DG、TM与3-MA合用组人鼻咽癌细胞存活率明显降低，均低于单用组，与阴性对照组比较均有统计学意义（P0.05）。 0.1mmol·L~(-1)3-MA和（或）0.5mmol·L~(-1)2-DG、0.1μmol·L~(-1)TM刺激细胞，采用集落克隆形成实验检测药物对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2增殖抑制作用的影响。结果表明：2-DG、TM在低浓度即可明显抑制CNE-1、CNE-2细胞的集落克隆形成，3-MA增强2-DG、TM的抑制作用。 2．5mmol·L~(-1)2-DG、1μmol·L~(-1)TM、1mmol·L~(-1)3-MA以及合用组处理人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-224h，线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）检测结果显示：阳性对照药CCCP（50μmol·L~(-1)）处理细胞20min，与阴性对照组比较细胞的红色荧光向绿色荧光转变比较明显，单用组没有观察到红色荧光向绿色荧光转变，合用组红色荧光向绿色荧光转变也比较明显；DAPI染色荧光显微镜观察细胞核形态学的变化，合用组人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞表现为细胞核皱缩浓集而呈亮蓝色荧光，或核呈分叶，碎片状；而在阴性对照组中及单独处理组中未发现异常形态的细胞核表现，可见细胞核轮廓清晰圆滑，发出淡蓝色荧光，结构均一。 3．Western blotting法检测自噬相关蛋白beclin1、LC3的变化，结果显示：阴性对照组人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2中，自噬反应处于较低水平，自噬相关蛋白beclin1表达较多，自噬相关蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化；而经过2-DG或TM处理组出现较强的自噬反应，自噬相关蛋白beclin1较对照组高，自噬相关蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化明显减少。3-MA与2-DG、TM联合处理组自噬相关蛋白beclin1表达明显降低，自噬相关蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化与2-DG、TM组比较明显减少。Immunocytochemistry法进一步观察了自噬相关蛋白的beclin1表达，与Westernblotting结果一致。结论： 1. DDP、IR对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2具有增殖抑制作用，且随着剂量（或浓度）的增加和作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低，但细胞对DDP、IR诱导的凋亡不敏感。作用机制可能与DDP、IR诱导的内质网应激所诱发的自噬的保护作用相关。 2.自噬抑制剂3-MA对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2具有增殖抑制作用，且随着剂量（或浓度）的增加和作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低。3-MA增强DDP、IR对人鼻咽癌细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用。作用机制可能与自噬抑制剂抑制细胞产生自噬相关。 3.自噬抑制剂3-MA增强内质网应激诱导剂2-DG、TM对人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2的增殖抑制及诱导凋亡作用，减弱内质网应激诱导剂诱导的自噬。进一步表明了人鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2对DDP、IR的不敏感性可能来自于内质网应激诱导的自噬所产生的保护作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.63

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