人胚胎干细胞向视网膜感光细胞诱导分化的实验研究

发布时间：2018-07-21 12:59

【摘要】：目的:1.使用不同的小分子化合物组合,诱导人胚胎干细胞向视网膜感光细胞分化,观察诱导化分化过程中各组不同阶段细胞形态学变化。2.从细胞水平、蛋白水平、基因水平检测人胚胎干细胞向视网膜感光细胞分化过程中Ki67、Sox2、Otx2、Rhodopsin的表达水平,比较不同小分子化合物作用下各组Ki67、Sox2、Otx2、Rhodopsin的表达规律及各组的分化程度和效率,探索更优化的诱导分化策略。方法:1.使用贴壁培养法培养人胚胎干细胞,在培养过程中使用不同的小分子化合物组合ABSRT、ABSRTA作用于人胚胎干细胞,观察诱导分化过程中各时期细胞形态,在诱导分化的第0天、第10天、第20天、第30天收取标本,利用免疫荧光染色检测诱导分化过程中各个时期细胞Ki67、Sox2、Otx2、Rhodopsin的表达规律。2.在诱导分化的第0天、第10天、第20天、第30天收取标本,采用Western Blot、qRT-PCR检测诱导分化过程中各时期细胞Ki67、Sox2、Otx2、Rhodopsin的表达水平,从蛋白水平、基因水平分析各组Ki67、Sox2、Otx2、Rhodopsin表达特点,比较各组的诱导分化效率。结果:1.显微镜下观察贴壁后的人胚胎干细胞形态,可见细胞逐渐由圆形拉长为长梭形,胞体透亮且折光性强,核大、核仁明显、核分裂像多见,细胞增殖分裂旺盛,细胞克隆集落相互融合成网状,在细胞复苏后60个小时细胞融合度可达约80%。2.人胚胎干细胞小克隆集落在铺有1%Matrigel的六孔板上生长后,第一天即可观察到细胞小克隆集落贴壁生长,中间密度大,细胞逐渐爬出由圆形拉伸为长梭形,在用2%Matrigel覆盖细胞两天后可观察到细胞克隆集落形成柱状神经上皮,诱导分化第十天可观察到玫瑰花结状结构形成,随诱导时间延长,细胞的轴突逐渐增多并伸长,细胞逐渐成熟,其形态与神经细胞接近。3.小分子化合物ABSRT组、ABSRTA组均可诱导人胚胎干细胞向视网膜感光细胞分化;ABSRT组、ABSRTA组均表现为随诱导时间延长Ki67表达水平逐渐下调,不同阶段下调程度不同,两组Sox2均阳性表达,且表达水平均上调,不同阶段上调程度不同,D30之前ABSRTA组上调程度高于ABSRT组,D30时ABSRT组上调程度高于ABSRTA组;两组Otx2、Rhodopsin均阳性表达,且表达水平均上调,不同阶段上调程度不同,ABSRTA组上调程度高于ABSRT组,不同小分子化合物组合诱导人胚胎干细胞向视网膜感光细胞分化的诱导效率不同,ABSRTA组诱导效率高于ABSRT组,ABSRTA组比ABSRT组诱导效率提高24.94%。结论:1.不同的小分子化合物ABSRT组、ABSRTA组均可定向诱导人胚胎干细胞分化为视网膜感光细胞。2.小分子化合物ABSRT组、ABSRTA组在诱导人胚胎干细胞向视网膜感光细胞分化过程中,随定向诱导时间的延长,干细胞标记基因Ki67表达水平均逐渐下调,视网膜感光细胞发育过程中的重要调控基因Sox2、Otx2均阳性表达,且表达上调,不同阶段上调程度不同,视网膜感光细胞特异性标记基因Rhodopsin均阳性表达,且表达上调,不同阶段上调程度不同,不同小分子化合物组合诱导人胚胎干细胞向视网膜感光细胞分化的诱导效率不同,ABSRTA组诱导效率高于ABSRT组,ABSRTA组比ABSRT组诱导效率提高24.94%。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of Ki - 67 , Sox2 , Otx2 and Rhodopsin in various stages of differentiation of human embryonic stem cells by using different small molecule combinations . The results showed that : 1 . The expression level of ABSRTA was higher than that of ABSRTA group , and the expression level was up - regulated . The expression level of ABSRTA group was higher than that of ABSTgroup . The induction efficiency of ABSRTA group was 24.94 % .
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R774.1

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本文编号：2135602