UBA52对HSF4转录活性调控的分子机制

发布时间：2017-04-12 18:23

  本文关键词：UBA52对HSF4转录活性调控的分子机制，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景白内障是世界范围内首要的致盲原因。成人白内障的发病率随年龄增加而升高,可高达60-80%。儿童白内障的发病率为0.015-0.03%,多与遗传因素有关。有报道HSF4突变与家族遗传性白内障的发生密切相关。基因敲除HSF4可诱发小鼠白内障,主要表现为晶状体上皮细胞异常增生和纤维细胞分化障碍。这说明HSF4是晶状体的主要调控因子之一。HSF4是热休克转录因子家族中的一员,与典型的热休克转录因子HSF1相比,其缺少抑制三聚化的HR-C疏水结构域,因此,细胞内HSF4转录活性调控机制不同于HSF1,仍待研究中。通过酵母双杂交实验,我们发现了一个新的与HSF4b相互作用的蛋白-UBA52。UBA52是由泛素和核糖体蛋白L40组成的融合蛋白,可成熟为泛素分子(ubiquitin)和核糖体蛋白(L40)。泛素是一个进化十分保守的蛋白质,在细胞内有许多重要的功能,其中最主要的是形成多聚泛素链修饰底物蛋白,使其通过泛素蛋白酶体途径进行降解。泛素化修饰对晶状体发育起着重要作用,突变Ub/K6W可抑制纤维细胞分化,导致白内障发生。因此,我们推测,UBA52介导的蛋白质质量控制通过与HSF4b结合激活晶状体细胞的热休克反应,继而维持分化细胞的内稳态。目的利用晶状体上皮细胞和BL/C57小鼠晶状体,探究UBA52对HSF4b转录活性调控的分子机制。方法1.利用重叠延伸法构建UBA52K48R/K63R/G75/76A突变质粒。2.运用逆转录病毒方法构建UBA52过表达的稳定株细胞系。3.免疫沉淀,GST-pull-down和ubiquitin-enrichment用于测定UBA52与HSF4b之间,HSF4b与Rpb1之间的相互作用。免疫荧光确定这些蛋白在细胞内的共定位。4.免疫印迹和实时定量PCR测定小鼠晶状体上皮细胞及晶状体组织中蛋白的表达。5.染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告实验检测UBA52对HSF4b的DNA结合能力的影响。结果1.UBA52在不同发育时期的晶状体上皮和纤维中均表达,并且可以在晶状体上皮细胞中成熟为ubiquitin和L40,且其ubiquitin端与HSF4b相互作用,但不直接泛素化修饰HSF4b。2.UBA52通过增强HSF4b的DNA结合能力来促进HSF4b的转录活性,进而增加HSF4b下游基因hsp25,αB-crystallin的mRNA和蛋白的表达;3.UBA52点突变(K48R,K63R,G75/76A)后,其成熟和定位发生改变,并进一步影响其与HSF4b的相互作用进而削弱其调控HSF4b转录活性的能力;4.HSF4b通过与Rpb1相互作用激活HSF4b的转录活性,UBA52可以与HSF4b和Rpb1形成复合物参与调控HSF4b的转录活性。结论晶状体上皮细胞中,UBA52可成熟为ubiquitin和L40,且UBA52在晶状体发育的各个时期都有表达。UBA52的ubiquitin端通过与HSF4b相互作用增强HSF4b的DNA结合能力,进而上调HSF4b的转录活性。Rpb1介导UBA52和HSF4b的相互作用和调控功能。以上研究结果表明,UBA52通过与HSF4b相互作用参与HSF4b介导的晶状体发育过程。
【关键词】：UBA52 HSF4 RNA聚合酶Ⅱ 晶状体发育
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R776.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 缩略词表10-11
• 引言11-13
• 1 材料、仪器13-19
• 1.1 材料和仪器13-19
• 1.1.1 抗体13
• 1.1.2 质粒，细胞，菌株及小鼠13-14
• 1.1.3 试剂盒14
• 1.1.4 其他材料14
• 1.1.5 主要仪器14-15
• 1.1.6 主要试剂配制15-19
• 2 主要研究方法19-31
• 2.1 细胞培养方法19-20
• 2.1.1 细胞复苏19
• 2.1.2 细胞传代19
• 2.1.3 细胞转染19
• 2.1.4 细胞冻存19-20
• 2.1.5 细胞爬片20
• 2.2 构建稳定株细胞系20
• 2.3 双荧光素酶报告实验20-21
• 2.4 免疫印迹21-22
• 2.5 提取细胞RNA22-23
• 2.6 免疫荧光23-24
• 2.7 免疫共沉淀（IP）24
• 2.8 pull down实验24-25
• 2.9 GST-pull down实验25-26
• 2.10 染色质免疫共沉淀26-27
• 2.11 重叠延伸法构建点突变质粒27-29
• 2.12 饲养小鼠29-30
• 2.13 晶状体剥离30-31
• 3 实验结果31-47
• 3.1 UBA52在晶状体上皮细胞中可以剪切为ubiquitin和L4031-32
• 3.2 HSF4b与UBA52的ubiquitin端相互作用32-34
• 3.3 UBA52不直接泛素化修饰HSF4b34-35
• 3.4 UBA52增加HSF4b下游基因hsp25，αB-crystallin的mRNA水平和蛋白水平的表达35-36
• 3.5 UBA52通过增强HSF4b的DNA结合能力来促进HSF4b的转录活性36-38
• 3.6 UBA52特定位点突变后会影响其成熟及定位改变38-39
• 3.7 UBA52点突变后影响其与HSF4b的相互作用进而削弱其调控HSF4b的转录活性的能力39-41
• 3.8 UBA52和HSF4b通过与Rpb1结合来调控HSF4b的转录活性41-42
• 3.9 细胞水平上，在蛋白毒性压力下，HSF4b与UBA52的结合增强42-43
• 3.10 UBA52在晶状体中的时空表达43-44
• 3.11 HSF4b与UBA52在晶状体组织中相互作用44-47
• 4 讨论47-51
• 结论51-53
• 参考文献53-57
• 综述57-66
• 参考文献62-66
• 致谢66-67
• 攻读学位期间参加的学术会议及研究成果67-68

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本文编号：301898