人脐带间充质干细胞对高糖环境中恒河猴视网膜血管内皮细胞的免疫调节作用

发布时间：2017-04-13 22:23

  本文关键词：人脐带间充质干细胞对高糖环境中恒河猴视网膜血管内皮细胞的免疫调节作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:观察人脐带间充质干细胞(h UCMSCs)对高糖培养的恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A)的影响及免疫调节机制,旨在为减轻早期DR微血管的损害及视网膜毛细血管血-视网膜屏障的损伤,延缓DR的进展。方法:本研究分为三组,即RF/6A空白对照组、高糖RF/6A组、h UCMSCs与高糖RF/6A共培养组。1、培养RF/6A细胞,利用复合培养体系(Transwell培养板)将h UCMSCs细胞加入Transwell系统的上层小室,下室加入含有25mmol/L的葡萄糖及RF/6A;将h UCMSCs按照1∶1比例与RF/6A共培养。培养液上下层小室中的大分子蛋白可以相互交流而细胞之间不互相接触,隔膜的孔径为0.4μm。2、采用MTT法测定各组RF/6A的细胞活力。计算不同条件作用后的细胞活力,实验重复3次,取平均值。计算公式:细胞活力(存活率)=实验组A值/正常组A值x100%。3、采用细胞划痕修复实验测定各组细胞的迁移能力,检测h UCMSCs对高糖环境中RF/6A细胞迁移能力的影响。4、采用细胞粘附实验测定各组细胞的粘附能力。粘附率=(实验组A值/对照组A值-1)x100%。5、采用Matrigel基质胶实验测定各组细胞的管腔形成能力,检测h UCMSCs对高糖环境中RF/6A细胞管腔形成能力的影响。6、采用Western blot检测各实验组Foxp3的蛋白表达量。7、采用酶联免疫吸附法,检测各组培养上清液中IL-1β、IL-17和ICAM-1的浓度。结果:1、成功建立h UCMSCs与RF/6A在高糖环境中共培养体系。2、MTT比色法测定高糖培养对RF/6A细胞活力的影响,三组行单因素方差分析进行比较,第1d时,三组细胞的存活率差异没有显著性(F=0.03,P0.05)。第3、7d时,高糖组与高糖共培养组的细胞存活率相比,差异有统计学意义(P0.05)。可以认为高糖可以降低RF/6A的细胞活力,抑制细胞增殖,而h UMSCs可以明显地提高高糖环境中RF/6A的细胞活力。3、细胞划痕修复实验研究RF/6A细胞的迁移能力。结果表明:三组行单因素方差分析,差异有统计学意义(F=189.7、369.4,p0.05),经LSD-t检验,与高糖共培养组相比,高糖组显著抑制RF/6A细胞的迁移(p0.05),差异有统计学意义。4、细胞粘附实验测定高糖环境对RF/6A粘附能力的影响,结果显示三组行单因素方差分析,差异有统计学意义(F=160.7,p0.05),经LSD-t检验,高糖共培养组与对照组相比,差异没有统计学意义(p0.05),高糖共培养组高糖组相比,差异有统计学意义(p0.05),提示高糖环境可以降低RF/6A细胞的粘附能力,h UMSCs可以增加高糖环境中RF/6A细胞的粘附能力。5、细胞管腔形成实验结果显示,三组行单因素方差分析,差异均有统计学意义(F=113.60、350.71,p0.05),与对照组相比,高糖组能抑制RF/6A的细胞管腔形成,抑制率为:2d 55.36%、1w 76.71%;高糖共培养组与对照组的血管腔形成相比较,抑制率为:2d 17.01%、1w 12.61%,与高糖组相比,高糖共培养组血管腔数目是其1.86倍(2d)、3.75倍(1w)。6、Western blot检测Foxp3蛋白表达。高糖培养1w后,foxp3蛋白表达与对照组相比出现明显下降,而与h UCMSCs共培养组的foxp3蛋白表达明显较高糖组多(p0.05)。7、酶联免疫吸附法测定对照组、高糖组和高糖共培养组各自收集的培养上清液中IL-1β、IL-17、ICAM-1的浓度。高糖组、高糖共培养组与对照组比较,上清液中IL-1β、IL-17、ICAM-1的浓度明显升高,差异具有显著性(p0.05)。结论高糖可以明显抑制RF/6A细胞的增殖、迁移、粘附、管腔形成能力,h UCMSCs能够增加RF/6A的增殖、迁移、粘附、管腔形成等细胞生物学能力,推测h UCMSCs通过调控Treg/Th17细胞表达平衡修复RF/6A细胞,对早期糖尿病视网膜病变具有免疫调节作用。
【关键词】：恒河猴视网膜血管内皮细胞 人脐带间充质干细胞 共培养 糖尿病视网膜病变 干细胞治疗
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R774.1;R587.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、hUMSCs对高糖环境中RF/6A细胞生物学影响15-31
• 1.1 对象和方法15-21
• 1.1.1 实验细胞15
• 1.1.2 主要试剂15
• 1.1.3 主要仪器材料15-16
• 1.1.4 主要溶液的配置16-17
• 1.1.5 实验方法17-21
• 1.2 结果21-26
• 1.2.1 RF/6A细胞和hUCMSCs的形态21-22
• 1.2.2 hUCMSCs与高糖RF/6A共培养模型的建立22
• 1.2.3 MTT法检测共培养后RF/6A细胞活力22-23
• 1.2.4 细胞划痕修复实验结果23-24
• 1.2.5 细胞黏附能力的测定24-25
• 1.2.6 细胞管腔形成能力的测定25-26
• 1.3 讨论26-29
• 1.3.1 高糖对猴视网膜血管内皮细胞细胞生长的影响26-27
• 1.3.2 MSCs对高糖环境中RF/6A细胞的影响27-28
• 1.3.3 MSCs干预早期DR的实验研究28
• 1.3.4 hUCMSCs干预早期DR的可能机制28-29
• 1.4 小结29-31
• 二、hUCMSCs对高糖环境中RF/6A细胞因子影响31-42
• 2.1 对象和方法31-34
• 2.1.1 实验细胞31
• 2.1.2 主要试剂及器械31
• 2.1.3 其他试剂及器械31
• 2.1.4 实验方法31-34
• 2.2 结果34-36
• 2.2.1 Western blot检测各实验组Foxp3的表达量34-35
• 2.2.2 酶联免疫吸附法测定三组各自收集的培养上清液中IL-1β、IL-17、ICAM-1 的浓度35-36
• 2.3 讨论36-41
• 2.3.1 IL-1β 与DR的研究36-37
• 2.3.2 ICAM-1 与DR的研究37-38
• 2.3.3 Treg/Th17失衡与DR可能机制的研究38-41
• 2.4 小结41-42
• 结论42-43
• 参考文献43-53
• 发表论文和参加科研情况说明53-54
• 综述 间充质干细胞治疗早期糖尿病视网膜病变的研究进展54-64
• 综述参考文献58-64
• 致谢64-65
• 个人简历65

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本文编号：304630