自噬调节高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞上皮间质转化
发布时间：2021-07-11 17:43
目的:探究自噬水平变化对高糖诱导人晶状体上皮细胞上皮间质转化（EMT）的影响及其机制。方法:人晶状体上皮细胞（HLE-B3）分为正常对照组（NC组）和高糖处理组（HG组）,分别用含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM和添加了30mmol/L葡萄糖的上述DMEM培养12、24、48h,用Western blot检测上皮间质转化标志蛋白（E-cadherin、α-SMA）和自噬标志蛋白（LC3、Beclin 1和SQSTM1/p62）的表达变化,用划痕实验观察细胞的移行能力以明确高糖对晶状体上皮细胞自噬和EMT的影响。利用雷帕霉素调节自噬水平,将细胞分为正常对照组（NC组）、高糖处理组（HG组）,高糖处理细胞的同时添加DMSO溶剂组（DMSO组）和添加200nmol/L雷帕霉素的雷帕霉素组（RAPA组）,处理细胞24h,用Transwell实验观察细胞的移行能力,用Western blot检测EMT、自噬标志蛋白和TGF-β信号通路蛋白（TGF-β2、Smad2/3、p-Smad2/3、Snail）的表达。用细胞免疫荧光染色观察SQSTM1/p62与Smad2/3在细胞内的表达,免疫共沉淀方...
【文章来源】：国际眼科杂志. 2020,20(05)北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
HLE-B3细胞在高糖环境下发生EMT
为了探讨自噬对HLE-B3细胞发生EMT的调节作用,我们使用自噬激动剂雷帕霉素(200nmol/L)对高糖刺激的HLE-B3细胞处理24h,用Western blot检测HLE-B3细胞自噬和EMT标志蛋白的表达变化。结果表明,与NC组相比,HG组HLE-B3细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ及E-cadherin蛋白表达降低(P=0.0042、0.0001),而α-SMA蛋白表达增加(P<0.0001),这与2.1部分的结果一致;RAPA组与HG组、DMSO组相比,LC3 Ⅱ/Ⅰ、E-cadherin蛋白表达水平有所提高(P<0.0001、=0.0087;P<0.0001、=0.0245),α-SMA蛋白表达水平有所降低(P=0.0001、<0.0001),但与NC组相比差异有统计学意义(P=0.0051、0.0136、<0.0001),DMSO组与HG组相比差异无统计学意义(P=0.9997、0.8625、0.7128),见图3A～D,表4,提示雷帕霉素可逆转高糖引起的自噬水平降低及EMT增强的变化。Transwell实验结果表明,与NC组相比,HG组和DMSO组细胞的移行数量显著增加(均P<0.0001),提示高糖促进了HLE-B3细胞的移行,而RAPA组细胞的移行数量明显低于HG组和DMSO组(P=0.0002、0.0004),但仍高于NC组(P=0.0021),提示雷帕霉素对高糖诱导的细胞移行有所抑制,与Western Blot结果相一致(图3E、F,表4)。表3 高糖环境对HLE-B3细胞自噬相关蛋白相对表达水平的影响 x ˉ ±s 培养时间 LC3Ⅱ/Ⅰ Beclin 1 SQSTM1/p62 0h 1.65±0.05 1.13±0.05 0.24±0.03 12h 1.17±0.06b 0.75±0.02b 0.66±0.03b 24h 0.62±0.07b,d 0.49±0.05b,d 0.81±0.02b,d 48h 0.66±0.07b,d 0.43±0.03b,d 0.99±0.04b,d,f F 163 206 302.1 P <0.0001 <0.0001 <0.0001 注:bP<0.01 vs 0h;dP<0.01 vs 12h;fP<0.01 vs 24h。
白内障是糖尿病患者视力损害的主要原因之一[14]。白内障摘除术仍是目前唯一有效的治疗方法[15]。与非糖尿病患者相比,糖尿病患者出现手术并发症风险较高,如囊膜收缩和混浊、黄斑水肿和糖尿病视网膜病变加重等[16]。所以,研究药物防治糖尿病白内障很有必要。人们对糖尿病白内障发病机理的探索从未停止,陈文静等[17]发现高糖可以抑制HLE-B3细胞葡萄糖关键代谢酶(6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶、己糖激酶、柠檬酸合成酶、α-酮戊二酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶)的表达,从而诱导细胞凋亡。本研究采用高糖刺激HLE-B3细胞以模拟糖尿病患者中晶状体上皮细胞的生存状态,观察晶状体上皮细胞EMT及自噬水平的改变,并通过雷帕霉素干预自噬水平,观察对细胞发生EMT的影响,探讨自噬对晶状体上皮细胞EMT的调节作用及其机制。表4 雷帕霉素对HLE-B3细胞自噬相关蛋白表达及迁移的影响 x ˉ ±s 组别 LC3 Ⅱ/Ⅰ E-cadherin α-SMA 迁移细胞数(个) NC组 1.61±0.10 1.16±0.12 0.45±0.05 26.67±3.06 HG组 1.16±0.10a 0.60±0.05a 1.16±0.04a 79.33±7.37a DMSO组 1.17±0.08a 0.65±0.04a 1.21±0.05a 77.00±2.65a RAPA组 2.04±0.14a,c,e 0.89±0.08a,c,e 0.81±0.06a,c,e 49.33±4.04a,c,e F 45.52 31.41 157.2 83.26 P <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 注:aP<0.05 vs NC组;cP<0.05 vs HG组;eP<0.05 vs DMSO组。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高糖诱导的人晶状体上皮细胞葡萄糖关键代谢酶的表达[J]. 陈文静,刘平. 国际眼科杂志. 2019(09)
[2]Ocular complications of diabetes mellitus[J]. Nihat Sayin,Necip Kara,G?khan Pekel. World Journal of Diabetes. 2015(01)
本文编号：3278553
【文章来源】：国际眼科杂志. 2020,20(05)北大核心
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
HLE-B3细胞在高糖环境下发生EMT
为了探讨自噬对HLE-B3细胞发生EMT的调节作用,我们使用自噬激动剂雷帕霉素(200nmol/L)对高糖刺激的HLE-B3细胞处理24h,用Western blot检测HLE-B3细胞自噬和EMT标志蛋白的表达变化。结果表明,与NC组相比,HG组HLE-B3细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ及E-cadherin蛋白表达降低(P=0.0042、0.0001),而α-SMA蛋白表达增加(P<0.0001),这与2.1部分的结果一致;RAPA组与HG组、DMSO组相比,LC3 Ⅱ/Ⅰ、E-cadherin蛋白表达水平有所提高(P<0.0001、=0.0087;P<0.0001、=0.0245),α-SMA蛋白表达水平有所降低(P=0.0001、<0.0001),但与NC组相比差异有统计学意义(P=0.0051、0.0136、<0.0001),DMSO组与HG组相比差异无统计学意义(P=0.9997、0.8625、0.7128),见图3A～D,表4,提示雷帕霉素可逆转高糖引起的自噬水平降低及EMT增强的变化。Transwell实验结果表明,与NC组相比,HG组和DMSO组细胞的移行数量显著增加(均P<0.0001),提示高糖促进了HLE-B3细胞的移行,而RAPA组细胞的移行数量明显低于HG组和DMSO组(P=0.0002、0.0004),但仍高于NC组(P=0.0021),提示雷帕霉素对高糖诱导的细胞移行有所抑制,与Western Blot结果相一致(图3E、F,表4)。表3 高糖环境对HLE-B3细胞自噬相关蛋白相对表达水平的影响 x ˉ ±s 培养时间 LC3Ⅱ/Ⅰ Beclin 1 SQSTM1/p62 0h 1.65±0.05 1.13±0.05 0.24±0.03 12h 1.17±0.06b 0.75±0.02b 0.66±0.03b 24h 0.62±0.07b,d 0.49±0.05b,d 0.81±0.02b,d 48h 0.66±0.07b,d 0.43±0.03b,d 0.99±0.04b,d,f F 163 206 302.1 P <0.0001 <0.0001 <0.0001 注:bP<0.01 vs 0h;dP<0.01 vs 12h;fP<0.01 vs 24h。
白内障是糖尿病患者视力损害的主要原因之一[14]。白内障摘除术仍是目前唯一有效的治疗方法[15]。与非糖尿病患者相比,糖尿病患者出现手术并发症风险较高,如囊膜收缩和混浊、黄斑水肿和糖尿病视网膜病变加重等[16]。所以,研究药物防治糖尿病白内障很有必要。人们对糖尿病白内障发病机理的探索从未停止,陈文静等[17]发现高糖可以抑制HLE-B3细胞葡萄糖关键代谢酶(6-磷酸果糖激酶-1、丙酮酸激酶、己糖激酶、柠檬酸合成酶、α-酮戊二酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶)的表达,从而诱导细胞凋亡。本研究采用高糖刺激HLE-B3细胞以模拟糖尿病患者中晶状体上皮细胞的生存状态,观察晶状体上皮细胞EMT及自噬水平的改变,并通过雷帕霉素干预自噬水平,观察对细胞发生EMT的影响,探讨自噬对晶状体上皮细胞EMT的调节作用及其机制。表4 雷帕霉素对HLE-B3细胞自噬相关蛋白表达及迁移的影响 x ˉ ±s 组别 LC3 Ⅱ/Ⅰ E-cadherin α-SMA 迁移细胞数(个) NC组 1.61±0.10 1.16±0.12 0.45±0.05 26.67±3.06 HG组 1.16±0.10a 0.60±0.05a 1.16±0.04a 79.33±7.37a DMSO组 1.17±0.08a 0.65±0.04a 1.21±0.05a 77.00±2.65a RAPA组 2.04±0.14a,c,e 0.89±0.08a,c,e 0.81±0.06a,c,e 49.33±4.04a,c,e F 45.52 31.41 157.2 83.26 P <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 注:aP<0.05 vs NC组;cP<0.05 vs HG组;eP<0.05 vs DMSO组。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高糖诱导的人晶状体上皮细胞葡萄糖关键代谢酶的表达[J]. 陈文静,刘平. 国际眼科杂志. 2019(09)
[2]Ocular complications of diabetes mellitus[J]. Nihat Sayin,Necip Kara,G?khan Pekel. World Journal of Diabetes. 2015(01)
本文编号：3278553
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