巨细胞病毒感染小鼠耳蜗上皮细胞非编码RNA差异性表达的筛选研究
发布时间：2021-09-05 06:28
研究目的:听力障碍是目前影响人类健康最为多见的疾病之一。而巨细胞病毒是引发婴幼儿先天性感染极为多见的病原体,同时也是导致人类非遗传性耳聋的主要原因。近年来,迅猛发展的高通量测序技术以及生物信息技术,使非编码RNA的研究更为深入。有研究报道巨细胞病毒感染后会引起非编码RNA表达变化,但缺少对巨细胞病毒感染致聋的过程中非编码RNA差异表达的相关报道。本研究拟通过构建的小鼠巨细胞病毒感染耳蜗感觉上皮细胞模型,用高通量检测技术对其进行全转录组测序,检测巨细胞病毒感染72 h的耳蜗感觉上皮细胞中非编码RNA的表达情况,利用生物信息学技术分析了各种非编码RNA的基本特点,筛选出差异表达的明显的非编码RNA并用qPCR方法进行验证。此项研究将探究出与巨细胞病毒感染耳聋致病相关的差异表达的非编码RNA,为从转录层面及非编码RNA角度进一步研究巨细胞病毒的致聋机制奠定了基础,并为后续进一步研究提供新的方向。研究方法:1.小鼠耳蜗上皮细胞（MCEC）、小鼠胚胎成纤维细胞（Balb/3T3）的培养。2.小鼠巨细胞病毒毒株（Smith株）的制备和TCID50测定病毒滴度,绘制病毒在小鼠胚胎成纤维细胞的生长曲线...
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
1MCMV感染Balb/3T3不同时间点荧光显微镜观察情况
中国医科大学硕士学位论文19图3.1.2MCMV一步生长曲线3.2MCMV感染与未感染72h小鼠耳蜗上皮细胞模型MCMVSmith株带有绿色荧光标签，可在荧光显微镜下观察其在细胞中的感染情况。MCMV感染MCEC72h时，处于病毒增长的指数期，此时细胞内病毒复制活跃，细胞感染率较高。abc图3.1MCMV感染与未感染72h小鼠耳蜗上皮细胞显微镜下图a为实验组MCMV感染小鼠耳蜗上皮细胞72h荧光显微镜下观察结果，b为MCMV感染小鼠耳蜗上皮细胞72h光学相差显微镜下观察结果：可见受感染的细胞边缘清晰可见，细胞变大，聚集，脱落、融合形成包涵体，甚至损伤、死亡等细胞病变效应(CPE)，c为对照组未感染的小鼠耳蜗上皮细胞72h光学相差显微镜下观察结果：细胞生长状态良好，未出现细胞病变效应。3.3测序样品质检结果及预处理结果提取MCMV感染72h和未感染72h的小鼠耳蜗感觉上皮细胞的总RNA，设
中国医科大学硕士学位论文20置三组生物学重复，共六个样本进行定量及质检。RNA样品建库质量要求如下：表3.3.1RNA样品建库质量要求所有RNA样品符合RNA-Seq样品建库的实验要求。RNA质检结果如表所示：表3.3.2RNA样品质检结果No.SmaplenameA260/280A260/230μg/μl[Nanodrop]μg/μl[Qubit]Amountμg质量描述1MCMV11.962.040.9620.54413.3合格2MCMV21.992.071.0400.56813.9合格3MCMV31.951.980.9460.50012.2合格4MCEC11.951.830.5640.3007.2合格5MCEC21.992.000.6260.3328.0合格6MCEC31.952.110.6500.3508.4合格图3.3RNA样品电泳结果图中1-3泳道是实验组MCMV感染72h的小鼠耳蜗感觉上皮细胞的总RNA的三组生物学重复，4-6泳道是未感染对照组的总RNA三组生物学重复，顺序与如上表格序号顺序一致，M泳道为标准阳性对照HelaCellControlRNA。3.4测序文库构建及测序数据质检结果分别构建小RNA文库和链特异性文库，小RNA文库主峰特异且无杂峰，长度在150bp左右。链特异性文库主峰特异且无杂峰，主峰长度在500bp左右，均达
【参考文献】：
期刊论文
[1]非编码RNA研究进展[J]. 陈玲玲,冯珊珊,范祖森,龚畅,刘本宇,刘子豪,李传伟,宋尔卫,孙树汉,吴庚泽,吴煌,吴缅,许光,袁继行,曾春雨,朱友明. 中国科学:生命科学. 2019(12)
[2]巨细胞病毒感染与耳聋相关性研究进展[J]. 李俎怡,何蓉. 国际儿科学杂志. 2019 (09)
[3]寻常型天疱疮外周血长链非编码RNA的差异性表达[J]. 刘洋,史丙俊,刁庆春,江雪,钱思宇,邓莉,王小琴. 中国皮肤性病学杂志. 2019(05)
[4]新生儿先天性巨细胞病毒感染的研究进展[J]. 喻欢,黄悦,卫飞雪,宋巧巧,苏迎盈,吴婷. 中国妇幼保健. 2018(14)
[5]高选择性和高灵敏度的microRNA检测技术的研究进展[J]. 陈珍珠,李蕊,田飞,沈彦婷,葛芹玉. 生物技术通报. 2016(04)
[6]非综合征型遗传性耳聋常见基因突变及检测方法的研究进展[J]. 陆小梅,彭琪,黎四平. 国际儿科学杂志. 2016 (02)
[7]转录组测序技术在生物测序中的应用研究进展[J]. 贾昌路,张瑶,朱玲,张锐. 分子植物育种. 2015(10)
[8]人类癌症中长链非编码RNA与miRNA相互作用的研究进展[J]. 尹凌帝,孙倩,孙明,德伟. 临床肿瘤学杂志. 2014(07)
[9]以突发听力下降为首发症状的遗传性耳聋病例分析[J]. 赵飞帆,王大勇,韩冰,纵亮,赵亚丽,李倩,王秋菊. 中华耳科学杂志. 2012(02)
[10]先天性人巨细胞病毒感染[J]. 王子威,侯新琳. 中国新生儿科杂志. 2011(05)
博士论文
[1]与A型流感病毒感染A549细胞相关的miRNA筛选与功能研究[D]. 夏炳辉.军事科学院 2018
[2]Argonaute2蛋白的泛素化调控[D]. 齐颖.天津医科大学 2016
硕士论文
[1]精神分裂症外周血差异表达的lncRNA的筛选和验证[D]. 杨梅.西南医科大学 2016
本文编号：3384860
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
1MCMV感染Balb/3T3不同时间点荧光显微镜观察情况
中国医科大学硕士学位论文19图3.1.2MCMV一步生长曲线3.2MCMV感染与未感染72h小鼠耳蜗上皮细胞模型MCMVSmith株带有绿色荧光标签，可在荧光显微镜下观察其在细胞中的感染情况。MCMV感染MCEC72h时，处于病毒增长的指数期，此时细胞内病毒复制活跃，细胞感染率较高。abc图3.1MCMV感染与未感染72h小鼠耳蜗上皮细胞显微镜下图a为实验组MCMV感染小鼠耳蜗上皮细胞72h荧光显微镜下观察结果，b为MCMV感染小鼠耳蜗上皮细胞72h光学相差显微镜下观察结果：可见受感染的细胞边缘清晰可见，细胞变大，聚集，脱落、融合形成包涵体，甚至损伤、死亡等细胞病变效应(CPE)，c为对照组未感染的小鼠耳蜗上皮细胞72h光学相差显微镜下观察结果：细胞生长状态良好，未出现细胞病变效应。3.3测序样品质检结果及预处理结果提取MCMV感染72h和未感染72h的小鼠耳蜗感觉上皮细胞的总RNA，设
中国医科大学硕士学位论文20置三组生物学重复，共六个样本进行定量及质检。RNA样品建库质量要求如下：表3.3.1RNA样品建库质量要求所有RNA样品符合RNA-Seq样品建库的实验要求。RNA质检结果如表所示：表3.3.2RNA样品质检结果No.SmaplenameA260/280A260/230μg/μl[Nanodrop]μg/μl[Qubit]Amountμg质量描述1MCMV11.962.040.9620.54413.3合格2MCMV21.992.071.0400.56813.9合格3MCMV31.951.980.9460.50012.2合格4MCEC11.951.830.5640.3007.2合格5MCEC21.992.000.6260.3328.0合格6MCEC31.952.110.6500.3508.4合格图3.3RNA样品电泳结果图中1-3泳道是实验组MCMV感染72h的小鼠耳蜗感觉上皮细胞的总RNA的三组生物学重复，4-6泳道是未感染对照组的总RNA三组生物学重复，顺序与如上表格序号顺序一致，M泳道为标准阳性对照HelaCellControlRNA。3.4测序文库构建及测序数据质检结果分别构建小RNA文库和链特异性文库，小RNA文库主峰特异且无杂峰，长度在150bp左右。链特异性文库主峰特异且无杂峰，主峰长度在500bp左右，均达
【参考文献】：
期刊论文
[1]非编码RNA研究进展[J]. 陈玲玲,冯珊珊,范祖森,龚畅,刘本宇,刘子豪,李传伟,宋尔卫,孙树汉,吴庚泽,吴煌,吴缅,许光,袁继行,曾春雨,朱友明. 中国科学:生命科学. 2019(12)
[2]巨细胞病毒感染与耳聋相关性研究进展[J]. 李俎怡,何蓉. 国际儿科学杂志. 2019 (09)
[3]寻常型天疱疮外周血长链非编码RNA的差异性表达[J]. 刘洋,史丙俊,刁庆春,江雪,钱思宇,邓莉,王小琴. 中国皮肤性病学杂志. 2019(05)
[4]新生儿先天性巨细胞病毒感染的研究进展[J]. 喻欢,黄悦,卫飞雪,宋巧巧,苏迎盈,吴婷. 中国妇幼保健. 2018(14)
[5]高选择性和高灵敏度的microRNA检测技术的研究进展[J]. 陈珍珠,李蕊,田飞,沈彦婷,葛芹玉. 生物技术通报. 2016(04)
[6]非综合征型遗传性耳聋常见基因突变及检测方法的研究进展[J]. 陆小梅,彭琪,黎四平. 国际儿科学杂志. 2016 (02)
[7]转录组测序技术在生物测序中的应用研究进展[J]. 贾昌路,张瑶,朱玲,张锐. 分子植物育种. 2015(10)
[8]人类癌症中长链非编码RNA与miRNA相互作用的研究进展[J]. 尹凌帝,孙倩,孙明,德伟. 临床肿瘤学杂志. 2014(07)
[9]以突发听力下降为首发症状的遗传性耳聋病例分析[J]. 赵飞帆,王大勇,韩冰,纵亮,赵亚丽,李倩,王秋菊. 中华耳科学杂志. 2012(02)
[10]先天性人巨细胞病毒感染[J]. 王子威,侯新琳. 中国新生儿科杂志. 2011(05)
博士论文
[1]与A型流感病毒感染A549细胞相关的miRNA筛选与功能研究[D]. 夏炳辉.军事科学院 2018
[2]Argonaute2蛋白的泛素化调控[D]. 齐颖.天津医科大学 2016
硕士论文
[1]精神分裂症外周血差异表达的lncRNA的筛选和验证[D]. 杨梅.西南医科大学 2016
本文编号：3384860
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