NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究
发布时间：2022-01-23 02:23
目的:本研究通过观察NSCs和OECs联合移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞神经营养因子,凋亡及抗凋亡蛋白因子表达影响,探讨细胞移植对SNHL损伤耳蜗细胞保护作用的部分机制。方法:（1）细胞培养:选取胎鼠作为移植细胞组织来源,对NSCs和OECs培养、形态观察及鉴定。（2）动物造模:采用庆大霉素对大鼠进行SNHL造模,将筛选出符合要求的大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组予NSCs和OECs联合移植,对照组予输注人工外淋巴液代替细胞移植。（3）细胞移植:将荧光标记的NSCs和OECs通过圆窗植入耳蜗内,术后记录各组大鼠体重变化,检测大鼠ABR听力阈值变化和听觉耳动反射阈值,并采集样本检测。（4）耳蜗切片HE染色。（5）耳蜗免疫荧光染色检测移植后NSCs和OECs荧光标记物。（6）TUNEL法检测凋亡细胞阳性细胞数和MOD值。（7）免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞。（8）Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达影响。结果:（1）细胞培养鉴定结果:NSCs染色鉴定标记物呈nestin阳性,OECs染色鉴定标记...
【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
雌雄大鼠合笼交配
第2章材料与方法132.3.5庆大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法耳毒性动物模型建立方法步骤：首先将SD大鼠先分为两组，空白组5只（正常饲养，未行任何处理）；造模组25只，参照Murillo-CuestaS等人造模方法[27、28]，造模组大鼠按每100mg/kg/d肌注庆大霉素注射液，连续用药2周，每日准时注射药物，在造模前及用药14d后检测大鼠ABR阈值，筛选符合听力要求大鼠。2.3.6实验动物分组及给药根据文献[27]方法在造模后筛选ABR检测阈值上升20dB以上的大鼠作为实验对象，本次造模共筛选出20只符合要求的大鼠，接着将造模成功后的大鼠按随机数字表法分为实验组和对照组，每组10只。实验组:予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，观察大鼠四肢腱反射消失后固定四肢，耳后皮肤剃毛，酒精消毒，手术刀片在耳后做弧形切口，组织剪分离皮下及肌肉组织，轻巧分离至听泡位置，暴露听泡，听泡上开一小孔，显示耳蜗底回、圆窗膜及镫骨动脉等解剖标志，镜下确定圆窗膜位置，用10μl微量注射器抽取4μl预先配备好的NSCs和OECs共培养细胞悬液，移植前将两者的浓度调整为1×105个/μl，将连接到微量注射器的细管的细端轻轻置入圆窗膜处，启动微量移液泵，时间设置为5min，缓慢将细胞悬液通过圆窗注入耳蜗，注射完毕后静置注射器3min，取就近小块肌浆组织封闭圆窗龛，当圆窗处无液体流出后，用骨水泥封闭听泡上的缺损，局部消毒，然后逐层缝合关闭。对照组：予滴入等量人工外淋巴液代替，术后保暖，正常饲养。图2大鼠手术部位
第2章材料与方法15的EDTA中，室内常温脱钙2周后取出耳蜗，经PBS清洗3次，放入20%的蔗糖24h后OCT浸透包埋，在平行于蜗轴方向，用切片机制作约8um厚度的切片，制备完成后放入-80oC超低温冰箱内保存，待用。图3大鼠耳蜗标本2.3.10切片染色操作步骤如下：①将制备好的耳蜗切片分别放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各15min，使切片脱蜡。②将耳蜗切片依次放入无水乙醇Ⅰ，无水乙醇Ⅱ各5min，洗脱耳蜗组织中残留的二甲苯，放入80%乙醇15min，充分水化。③切片使用自来水浸洗3min，避免直接水冲，接着使用苏木精液染色5min，用流水洗去苏木精液。④接着放入1%盐酸酒精进行分化5s，再次自来水流动浸洗1min。接着将切片浸入0.5%伊红液染色3min，蒸馏水浸洗10s，最后依次分别置入80%乙醇30s，95%乙醇30s，无水乙醇Ⅰ1min，无水乙醇Ⅱ5min，切片脱水。⑤最后将耳蜗切片依次放入二甲苯Ⅰ2min，二甲苯Ⅱ5min，二甲苯Ⅲ5min，耳蜗切片烘干后，中性树胶、甘油封固片，显微镜下观察大鼠耳蜗切片的细胞形态变化。2.3.11耳蜗免疫荧光染色操作步骤如下：将耳蜗切片用PBS漂洗3次，每次5min，置入0.1%TritonX-100和5%山羊血清混合室温封闭60min。接着移去封闭液，PBS漂洗3次，滴加一抗，各组在4℃孵育过夜，PBS漂洗3次；滴加二抗，按1:100稀释的FITC标记的山羊抗兔IgG，室温孵育2h，PBS漂洗3次x5min，DAPI工作液染核，室温下避光孵育10min。最后用0.3%TitonX-100PBS洗涤三遍，每遍5min洗涤，贴片，封
【参考文献】：
期刊论文
[1]突发性耳聋病因及其与内耳免疫学研究进展[J]. 顾文菁,于红,任大伟,王宇声. 中国老年学杂志. 2019(23)
[2]BMSCs移植联合应用G-CSF对放射性脊髓损伤凋亡因子表达的影响[J]. 佟旭,陈颖,张拓,刘颖,徐倩倩,刘彦章,毕红霞,罗福申,张娜. 齐齐哈尔医学院学报. 2019(22)
[3]三七总皂苷对小鼠脑缺血再灌注损伤海马Bax、Bcl-2表达的影响[J]. 李衍兴,陈燕珊,潘鹏春,张少君,陈小娟,李若兰,陈盛强. 湖南中医杂志. 2019(10)
[4]温肺降浊方对血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响[J]. 吴林,唐农,麻小梅,陈炜,郑福奎,赵海涛,白硕宇,曾冬娟,杨惠丹,邓燕. 中国老年学杂志. 2019(20)
[5]Caspase家族与神经细胞凋亡的研究进展[J]. 苏胜有. 世界最新医学信息文摘. 2019(80)
[6]BMSCs移植对视神经损伤家猫RGCs损伤及BDNF表达的影响[J]. 李俊义,李秀梅,万京明,刘娟,毕京玉,姜彦,李娜. 现代生物医学进展. 2019(18)
[7]骨髓间充质干细胞移植对Ⅶ型胶原酶诱导的脑出血大鼠模型神经功能的保护作用[J]. 阎晓玲,张学斌,唐帆,孔繁明,杜从斌,苏心,王新平. 中国现代神经疾病杂志. 2019(09)
[8]Bcl2基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤大鼠实验研究[J]. 姜福贵,李俊,沈成华,陈劲松,蒋文昊. 创伤与急危重病医学. 2019(05)
[9]干细胞来源及内耳导入途径的研究进展[J]. 田海月,向大伟,王新兰,钟翠萍. 中华耳科学杂志. 2019(03)
[10]脑源性神经营养因子对皮质酮诱导新生大鼠海马神经元凋亡的保护作用[J]. 王英俊,董玉斌,栾永刚,曹亚芹,黄娜娜. 实用预防医学. 2019(06)
硕士论文
[1]嗅鞘细胞及其相关细胞培养的基础性研究[D]. 花保安.安徽理工大学 2012
[2]嗅鞘细胞促损伤大鼠耳蜗螺旋神经节细胞保护和修复作用的实验研究[D]. 张志存.复旦大学 2011
[3]卡那霉素耳慢性中毒后豚鼠耳蜗细胞凋亡及其调控机制的研究[D]. 杨俊慧.第三军医大学 2002
本文编号：3603401
【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
雌雄大鼠合笼交配
第2章材料与方法132.3.5庆大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法耳毒性动物模型建立方法步骤：首先将SD大鼠先分为两组，空白组5只（正常饲养，未行任何处理）；造模组25只，参照Murillo-CuestaS等人造模方法[27、28]，造模组大鼠按每100mg/kg/d肌注庆大霉素注射液，连续用药2周，每日准时注射药物，在造模前及用药14d后检测大鼠ABR阈值，筛选符合听力要求大鼠。2.3.6实验动物分组及给药根据文献[27]方法在造模后筛选ABR检测阈值上升20dB以上的大鼠作为实验对象，本次造模共筛选出20只符合要求的大鼠，接着将造模成功后的大鼠按随机数字表法分为实验组和对照组，每组10只。实验组:予10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，观察大鼠四肢腱反射消失后固定四肢，耳后皮肤剃毛，酒精消毒，手术刀片在耳后做弧形切口，组织剪分离皮下及肌肉组织，轻巧分离至听泡位置，暴露听泡，听泡上开一小孔，显示耳蜗底回、圆窗膜及镫骨动脉等解剖标志，镜下确定圆窗膜位置，用10μl微量注射器抽取4μl预先配备好的NSCs和OECs共培养细胞悬液，移植前将两者的浓度调整为1×105个/μl，将连接到微量注射器的细管的细端轻轻置入圆窗膜处，启动微量移液泵，时间设置为5min，缓慢将细胞悬液通过圆窗注入耳蜗，注射完毕后静置注射器3min，取就近小块肌浆组织封闭圆窗龛，当圆窗处无液体流出后，用骨水泥封闭听泡上的缺损，局部消毒，然后逐层缝合关闭。对照组：予滴入等量人工外淋巴液代替，术后保暖，正常饲养。图2大鼠手术部位
第2章材料与方法15的EDTA中，室内常温脱钙2周后取出耳蜗，经PBS清洗3次，放入20%的蔗糖24h后OCT浸透包埋，在平行于蜗轴方向，用切片机制作约8um厚度的切片，制备完成后放入-80oC超低温冰箱内保存，待用。图3大鼠耳蜗标本2.3.10切片染色操作步骤如下：①将制备好的耳蜗切片分别放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各15min，使切片脱蜡。②将耳蜗切片依次放入无水乙醇Ⅰ，无水乙醇Ⅱ各5min，洗脱耳蜗组织中残留的二甲苯，放入80%乙醇15min，充分水化。③切片使用自来水浸洗3min，避免直接水冲，接着使用苏木精液染色5min，用流水洗去苏木精液。④接着放入1%盐酸酒精进行分化5s，再次自来水流动浸洗1min。接着将切片浸入0.5%伊红液染色3min，蒸馏水浸洗10s，最后依次分别置入80%乙醇30s，95%乙醇30s，无水乙醇Ⅰ1min，无水乙醇Ⅱ5min，切片脱水。⑤最后将耳蜗切片依次放入二甲苯Ⅰ2min，二甲苯Ⅱ5min，二甲苯Ⅲ5min，耳蜗切片烘干后，中性树胶、甘油封固片，显微镜下观察大鼠耳蜗切片的细胞形态变化。2.3.11耳蜗免疫荧光染色操作步骤如下：将耳蜗切片用PBS漂洗3次，每次5min，置入0.1%TritonX-100和5%山羊血清混合室温封闭60min。接着移去封闭液，PBS漂洗3次，滴加一抗，各组在4℃孵育过夜，PBS漂洗3次；滴加二抗，按1:100稀释的FITC标记的山羊抗兔IgG，室温孵育2h，PBS漂洗3次x5min，DAPI工作液染核，室温下避光孵育10min。最后用0.3%TitonX-100PBS洗涤三遍，每遍5min洗涤，贴片，封
【参考文献】：
期刊论文
[1]突发性耳聋病因及其与内耳免疫学研究进展[J]. 顾文菁,于红,任大伟,王宇声. 中国老年学杂志. 2019(23)
[2]BMSCs移植联合应用G-CSF对放射性脊髓损伤凋亡因子表达的影响[J]. 佟旭,陈颖,张拓,刘颖,徐倩倩,刘彦章,毕红霞,罗福申,张娜. 齐齐哈尔医学院学报. 2019(22)
[3]三七总皂苷对小鼠脑缺血再灌注损伤海马Bax、Bcl-2表达的影响[J]. 李衍兴,陈燕珊,潘鹏春,张少君,陈小娟,李若兰,陈盛强. 湖南中医杂志. 2019(10)
[4]温肺降浊方对血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响[J]. 吴林,唐农,麻小梅,陈炜,郑福奎,赵海涛,白硕宇,曾冬娟,杨惠丹,邓燕. 中国老年学杂志. 2019(20)
[5]Caspase家族与神经细胞凋亡的研究进展[J]. 苏胜有. 世界最新医学信息文摘. 2019(80)
[6]BMSCs移植对视神经损伤家猫RGCs损伤及BDNF表达的影响[J]. 李俊义,李秀梅,万京明,刘娟,毕京玉,姜彦,李娜. 现代生物医学进展. 2019(18)
[7]骨髓间充质干细胞移植对Ⅶ型胶原酶诱导的脑出血大鼠模型神经功能的保护作用[J]. 阎晓玲,张学斌,唐帆,孔繁明,杜从斌,苏心,王新平. 中国现代神经疾病杂志. 2019(09)
[8]Bcl2基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤大鼠实验研究[J]. 姜福贵,李俊,沈成华,陈劲松,蒋文昊. 创伤与急危重病医学. 2019(05)
[9]干细胞来源及内耳导入途径的研究进展[J]. 田海月,向大伟,王新兰,钟翠萍. 中华耳科学杂志. 2019(03)
[10]脑源性神经营养因子对皮质酮诱导新生大鼠海马神经元凋亡的保护作用[J]. 王英俊,董玉斌,栾永刚,曹亚芹,黄娜娜. 实用预防医学. 2019(06)
硕士论文
[1]嗅鞘细胞及其相关细胞培养的基础性研究[D]. 花保安.安徽理工大学 2012
[2]嗅鞘细胞促损伤大鼠耳蜗螺旋神经节细胞保护和修复作用的实验研究[D]. 张志存.复旦大学 2011
[3]卡那霉素耳慢性中毒后豚鼠耳蜗细胞凋亡及其调控机制的研究[D]. 杨俊慧.第三军医大学 2002
本文编号：3603401
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