基于CRISPR/Cas9技术建立敲除OSBPL2基因的HeLa细胞株

发布时间：2022-12-05 20:26

　　目的 :利用CRISPR/Cas9技术构建OSBPL2基因敲除的稳定HeLa细胞株。方法 :设计3个单导向RNA（singleguide RNA,sg RNA）,分别靶向OSBPL2基因的第2、3和5外显子,以PGK1.1为载体,构建出3个重组真核表达载体。分别转染HeLa细胞后,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,Cruiser TM敲除检测实验和测序共同检验载体靶向效率。选出靶向效率最高的质粒转染HeLa细胞,进行单克隆细胞培养,最后用Western blot鉴定敲除效果。结果:sg RNA正确插入到PGK1.1载体,靶向第2外显子的重组载体转染HeLa细胞并筛选单克隆后,细胞未检测出OSBPL2蛋白的表达。结论:敲除OSBPL2基因的稳定HeLa细胞株构建成功。 

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【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 单导向RNA(single-guide RNA,sg RNA)靶点选择及其寡核苷酸链合成
        1.2.2 PGK1.1-sg RNA载体构建
        1.2.3 细胞培养和细胞转染
        1.2.4 药物筛选和细胞基因组DNA提取
        1.2.5 PCR以及CruiserTM敲除检测实验
        1.2.6 筛选OSBPL2基因稳定敲除细胞株
        1.2.7 Western blot检测
2 结果
    2.1 sg RNA靶点以及寡核苷酸序列确定
    2.2 PGK1.1-sg RNA重组载体的PCR验证和测序结果
    2.3 药物筛选、混合克隆测序验证和CruiserTM敲除检测实验
    2.4 阳性克隆的筛选与鉴定
    2.5 Western blot检测OSBPL2 Exon2敲除后OSB-PL2蛋白的表达
3 讨论



本文编号：3710295