不同浓度氯化锌对紫外线损伤的人晶状体上皮细胞的影响及作用机制研究

发布时间：2017-05-19 05:07

  本文关键词：不同浓度氯化锌对紫外线损伤的人晶状体上皮细胞的影响及作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究不同浓度氯化锌(ZnCl2)对紫外线B(UVB)照射后人晶状体上皮细胞系B-3(human lens epithelial cell B-3,HLE B-3)细胞的细胞内钙离子(calcium ion,Ca2+)水平、钙ATP酶(Ca2+-ATP酶)相关基因及蛋白表达的调节,从而探讨适宜浓度ZnCl2对UVB诱发HLE B-3细胞凋亡的可能保护作用及相关机制。方法:HLE B-3细胞进行培养及传代,不同浓度ZnCl2对细胞进行预处理2 h,40 mJ/cm2剂量的UVB照射细胞。实时细胞电子分析法检测HLE B-3细胞生长的影响;JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,ΔΨm)的变化;DCFH-DA染色法检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的变化;Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡的变化;Fluo-3/AM染色法检测细胞内Ca2+浓度的变化;实时荧光定量PCR检测ZnCl2及UVB对细胞质膜钙ATP酶1(Plasma membrane calcium ATPase 1,PMCA1),细胞质膜钙ATP酶4(Plasma membrane calcium ATPase 4,PMCA4),人肌质/内质网钙ATP酶2(Sarcoplasmic endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2b,SERCA2b)及人肌质/内质网钙ATP酶3(Sarcoplasmic endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 3,SERCA3)在mRNA水平表达的影响;酶联免疫吸附试验检测PMCA1、PMCA4、SERCA2b及SERCA3在蛋白质水平表达的变化。结果:适宜浓度的ZnCl2预处理,可以减轻UVB对HLE B-3细胞增殖的抑制作用;适宜浓度ZnCl2预处理可以抑制UVB导致的HLE B-3细胞ΔΨm降低,减少ROS产生,促进细胞钙稳态恢复,减少HLE B-3细胞坏死和凋亡。适宜浓度ZnCl2预处理可以抑制UVB照射诱导的SERCA2b和SERCA3上调表达,同时明显上调PMCA1和PMCA4的表达。结论:适宜浓度ZnCl2预处理能抑制UVB导致的HLE B-3细胞Ca2+浓度增高、ΔΨm下降、ROS增加,进而减少细胞凋亡和坏死。PMCA和SERCA在适宜浓度ZnCl2对UVB损伤的HLE B-3细胞的保护作用中可能起重要作用。
【关键词】：紫外线B 钙稳态 氯化锌 质膜钙ATP酶 肌质/内质网钙ATP酶
【学位授予单位】：山东中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R776.1
【目录】：

• 提要3-4
• Abstract4-8
• 引言8-11
• 1. 材料与方法11-28
• 1.1 实验材料11-15
• 1.1.1 培养细胞11
• 1.1.2 细胞培养相关试剂及配制11-12
• 1.1.3 实时荧光定量PCR相关试剂12-13
• 1.1.4 其他实验相关试剂13-14
• 1.1.5 主要仪器与设备14-15
• 1.2 ZnCl_2对UVB损伤的保护作用研究的实验步骤和方法15-23
• 1.2.1 晶状体上皮细胞培养、传代、冻存及复苏15-16
• 1.2.2 紫外线照射16
• 1.2.3 实时细胞电子分析16-17
• 1.2.4 流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化17-18
• 1.2.5 细胞内活性氧水平的检测18-19
• 1.2.6 Annexin V-FITC/PI染色法细胞凋亡的检测19-20
• 1.2.7 细胞内Ca~(2+)水平的检测20
• 1.2.8 实时荧光定量PCR20-21
• 1.2.9 ELISA检测PMCA1、PMCA4、SERCA2b及SERCA3蛋白表达的变化21-22
• 1.2.10 统计学分析22-23
• 1.3 高浓度ZnCl_2对晶状体上皮细胞的损伤机制研究的实验步骤和方法23-28
• 1.3.1 晶状体上皮细胞培养、传代、冻存及复苏23
• 1.3.2 ZnCl_2溶液的配制23
• 1.3.3 高浓度ZnCl_2对晶状体上皮细胞生存的影响23-24
• 1.3.4 线粒体膜电位的变化24-25
• 1.3.5 细胞周期的检测25
• 1.3.6 细胞凋亡的检测25-26
• 1.3.7 实时荧光定量PCR26
• 1.3.8 ELISA检测相关蛋白表达的变化26-27
• 1.3.9 统计学分析27-28
• 2. 结果28-45
• 2.1 ZnCl_2对UVB损伤的保护作用研究28-35
• 2.1.1 实时细胞电子分析28-29
• 2.1.2 流式细胞仪检测 ΔΨm变化29-30
• 2.1.3 流式细胞仪检测细胞内ROS变化30-31
• 2.1.4 Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡31-32
• 2.1.5 细胞内Ca~(2+)水平的检测32-33
• 2.1.6 PMCA1, PMCA4, SERCA2b和SERCA3基因和蛋白表达水平的检测33-35
• 2.2 高浓度ZnCl_2对晶状体上皮细胞的损伤机制研究35-45
• 2.2.1 细胞形态的观察35
• 2.2.2 MTT法检测35-36
• 2.2.3 RT-CES分析36-38
• 2.2.4 ΔΨm变化38
• 2.2.5 细胞周期检测38-39
• 2.2.6 细胞凋亡的检测39-42
• 2.2.7 细胞内TGF-β1，Caspase-12，，Caspase-9 和TNF-α 基因及蛋白水平检测42-45
• 3. 讨论45-51
• 3.1 ZnCl_2对HLE B-3 细胞生长的影响45
• 3.2 ZnCl_2对UVB损伤的保护作用研究45-48
• 3.3 高浓度ZnCl_2对晶状体上皮细胞的损伤机制研究48-51
• 4. 结语51-52
• 参考文献52-59
• 中英文对照59-61
• 附录61-63
• 致谢63-64
• 论文著作64-66
• 详细摘要66-70

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