酪氨酸促进人胚胎干细胞向视网膜色素上皮高效分化的研究

发布时间：2017-05-27 09:07

  本文关键词：酪氨酸促进人胚胎干细胞向视网膜色素上皮高效分化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的观察酪氨酸(L-Tyrosine)对人胚胎干细胞(h ESCs)向视网膜色素上皮(RPE)细胞定向分化诱导效率的影响。方法1.人胚胎干细胞培养和人视网膜色素上皮细胞分离(1)人胚胎干细胞H1(h ESCs)在Matrigel包被的培养板上使用m Te SR培养基单层贴壁培养。观察细胞形态。(2)酶消化法分离人视网膜色素上皮细胞,观察细胞形态,使用RP-PCR和Western blot检测RPE标志。2.人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞定向分化(1)诱导分化人胚胎干细胞H1(h ESC)分为对照组和实验组,以m Te SR培养基常规培养。细胞克隆过度融合后对照组以撤除碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)、含10%KSR的培养基诱导h ESCs自主分化。实验组从诱导分化第14天开始在诱导体系中分别添加0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.25 mmol/L和0.5 mmol/L酪氨酸,处理7天,探索最适酪氨酸诱导浓度;从诱导分化第0天、第7天、第14天、第21天和第28天开始在诱导体系中分别按筛选出的最适酪氨酸诱导浓度添加酪氨酸,处理7天,探索最适酪氨酸诱导时间点;使用酪氨酸最适诱导浓度在最适时间点开始诱导,处理7天。3.鉴定(1)体外功能鉴定分别检测各组细胞诱导分化第35天、第49天,hRPE,hESCs和纯化的h ESCs-RPE细胞MITF、RPE65、PAX6、CRALBP、RX、PEDF、ZO1、BF1、Tyrosinase、Wnt3a、Lef1、Tcf7、c-myc基因m RNA的相对表达;蛋白免疫印迹法检测PAX6、MITF、RPE65、CRALBP和β-catenin蛋白的表达;流式细胞术检测0.2 m M酪氨酸处理组和对照组PAX6、CRALBP、MITF、ZO1和RPE65阳性细胞比例;细胞免疫荧光检测纯化h ESCs-RPE PAX6、CRALBP、MITF、ZO1和RPE65蛋白表达水平。(2)h ESCs-RPE对急性视网膜变性大鼠视功能具有保护作用16只视网膜变性大鼠随机分为对照组和治疗组,单眼内路法视网膜下腔注射,对照组注射2ul 1倍磷酸盐缓冲液,治疗组注射2 ul纯化的h ESCs-RPE(1x106个)。治疗6周后行视网膜电图(ERG)检查,观察暗适应3.0 a-b波振幅。结果1.诱导分化第22天,0.2 m M酪氨酸处理组开始出现肉眼可见的色素团块,诱导分化第5周0.2 m M酪氨酸处理组色素团块明显多于对照组。色素化区域内可见多边形蜂窝状排列的单层细胞,胞质充满色素颗粒,与人视网膜色素上皮细胞形态相近。2.RT-PCR结果显示,经单因素方差分析各浓度处理组在诱导分化第35天和第49天RPE特异性基因PAX6、CRALBP、MITF、RPE65、BF1、PEDF、RX、Tyrosinase和ZO1基因表达量均高于对照组(p=0.000),其中0.2 m M和0.5 m M处理组各基因第35天和49天表达量均明显高于其他组(p=0.000);与对照组相比,各时间点使用0.2 m M L-Tyrosine对h ESCs-RPE诱导的RPE特异性基因PAX6、CRALBP、MITF、RPE65、BF1、PEDF、RX、Tyrosinase和ZO1的相对表达量差异均有统计学意义(P=0.000),其中d7、d21和d28加入0.2 m M L-Tyrosine处理组细胞MITF、RPE65、ZO1、Tyrosinase基因表达量明显高于其他组(p=0.000)。酪氨酸处理组Wnt3a、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Lef1、Myc、Tcf7 m RNA表达量高于对照组,差异有统计学意义(p=0.000)。Western blot检测结果显示,酪氨酸处理组MITF、RPE65、CRALBP、PAX6、β-catenin蛋白表达量高于对照组。ICC检测结果显示纯化的h ESCs-RPE表达RPE标志蛋白RPE65、PAX6、CRALBP、ZO1和MITF。FCM检测结果显示,诱导分化第35天L-Tyrosine处理组MITF、PAX6和RPE65阳性比例分为25.97%±3.31%,82.18%±6.42%,13.82%±0.47%,对照组分别为9.53%±1.01%,31.72%±5.89%,6.13%±1.18%,差异显著(t=4.755,p=0.009;t=5.794,p=0.029;t=6.067,p=0.004)。诱导分化第49天L-Tyrosine处理组MITF、CRALBP和RPE65阳性比例分为60.65%±1.71%,24.38%±2.21%,44.70%±2.10%,对照组分别为17.41%±1.29%,10.92%±1.53%,8.72%±0.73%,差异显著(t=20.18,p=0.000;t=5.150,p=0.007;t=16.19,p=0.000)ERG检查结果显示,视网膜下腔注射h ESC-RPE 6周后视网膜变性大鼠暗适应0.01,3.0和30.0 a-b波幅较对照组显著提高(P0.01)。结论酪氨酸显著提高h ESCs向RPE定向诱导效率,对Wnt/β-catenin信号通路活性的影响为其可能的作用机制。h ESCs诱导来源的RPE细胞视网膜下移植能改善急性视网膜变性模型动物视功能。
【关键词】：胚胎干细胞 分化 视网膜色素上皮 酪氨酸
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.1
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 1.1 材料和仪器15-21
• 1.1.1 实验所用细胞15
• 1.1.2 实验所用动物15
• 1.1.3 实验所用主要试剂15-17
• 1.1.4 实验所用主要仪器和耗材17-18
• 1.1.5 实验所用溶液及制方法18-21
• 1.2 实验方法21-39
• 1.2.1 细胞培养21-27
• 1.2.1.1 人胚胎干细胞H1体外培养、传代21-23
• 1.2.1.2 人胚胎干细胞 H1 向人视网膜色素上皮细胞定向诱导23-24
• 1.2.1.3 人胚胎干细胞源性视网膜色素上皮细胞的分离、纯化培养、传代和冻存24-26
• 1.2.1.4 人视网膜色素上皮细胞（h RPE）的分离、体外纯化培养、传代和冻存26-27
• 1.2.2 细胞总 RNA 提取及浓度测定27-28
• 1.2.3 RNA 逆转录合成单链cDNA28
• 1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应28-30
• 1.2.5 细胞蛋白提取及浓度测定30-32
• 1.2.6 免疫印迹试验鉴定hESCs-RPE细胞32-33
• 1.2.7 细胞免疫荧光试验鉴定hESCs-RPE细胞33-34
• 1.2.8 流式细胞术检测 L-Tyrosine 处理组和对照组诱导效率34-36
• 1.2.9 碘酸钠诱导急性视网膜变性大鼠模型36
• 1.2.10 纯化的 h ESCs-RPE 移植对急性视网膜变性大鼠视功能保护作用36-37
• 1.2.11 L-Tyrosine 促进人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞高效分化机制的初步研究37-39
• 1.3 结果39-62
• 1.3.1 人胚胎干细胞 H1 体外培养的形态学特征39
• 1.3.2 不同浓度 L-Tyrosine 对 h ESCs-RPE 诱导效率的影响39-43
• 1.3.3 不同时间点 L-Tyrosine 处理对 h ESCs-RPE 诱导效率的影响43-46
• 1.3.4 形态学观察比较 L-Tyrosine 处理组与对照组诱导效率46-47
• 1.3.5 流式细胞学检测比较 L-Tyrosine 处理组与对照组诱导效率47-51
• 1.3.6 人视网膜色素上皮细胞的体外培养和鉴定51
• 1.3.7 hESCs-RPE细胞纯化和鉴定51-56
• 1.3.8 视网膜下腔移植 h ESCs-RPE 对急性视网膜色素变性大鼠模型视功能的保护作用56-57
• 1.3.9 L-Tyrosine 促进人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞高效分化的可能的机制研究57-62
• 1.4 讨论62-67
• 1.4.1 人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞定向诱导62-63
• 1.4.2 RPE 细胞特异性标记63-64
• 1.4.3 hRPE获取和鉴定64-65
• 1.4.4 L-Tyrosine 促进人胚胎干细胞向视网膜色素上皮定向高效分化65-66
• 1.4.5 hESCs-RPE体内功能初步鉴定66-67
• 结论67-68
• 参考文献68-71
• 发表论文和参加科研情况说明71-72
• 综述72-76
• 综述参考文献76-79
• 致谢79

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