热休克蛋白抑制剂对人鼻咽癌细胞增殖和凋亡的研究

发布时间：2017-06-15 21:11

  本文关键词：热休克蛋白抑制剂对人鼻咽癌细胞增殖和凋亡的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：实验目的:研究不同浓度的Hsp90抑制剂17-AAG和儿茶素(EGCG)单药或联合使用时对人鼻咽癌CNE细胞的凋亡诱导作用,以探讨新的分子靶点对鼻咽癌的治疗,为Hsp90抑制剂单独或联合儿茶素(EGCG)治疗鼻咽癌、增强其治疗效果提供实验依据。实验方法:1.MTT比色法检测药物抑制效应,研究不同浓度的17-AAG、EGCG单药或联合作用24h、48h和72h对人鼻咽癌CNE细胞的体外增殖抑制效应;2.利用Hoechst 33258荧光染色法观察人鼻咽癌CNE细胞在不同浓度17-AAG、EGCG单药或联合作用48h引起的细胞形态学的变化;3.利用吖啶橙(A0)荧光染色法在荧光显微镜下观察人鼻咽癌CNE细胞在17-AAG(0.625μmol/L)、EGCG(80mg/L)单独以及联合作用48h引起的细胞形态学的变化;4.利用吖啶橙(A0)/溴化乙锭(EB)荧光双染色法在荧光显微镜下观察人鼻咽癌CNE细胞在不同浓度17-AAG、EGCG单药及联合作用48h,引起的细胞形态学的变化;5.流式细胞术(FACS)分析不同浓度17-AAG、EGCG单独及联合用药48h对人鼻咽癌CNE细胞周期的变化;6.Annexin V-FITC/PI双染法检测人鼻咽癌CNE细胞在17-AAG(0.625μmol/L)、EGCG(40mg/L)单独以及联合作用48h,细胞凋亡率的变化;7.RT-PCR法检测CNE细胞在17-AAG(0.625μmol/L)、EGCG(80mg/L)单独以及联合作用48h,凋亡基因Bcl-2、Bax的m RNA表达和凋亡信号转导分子Caspase-3的m RNA表达。8.Western Blotting检测人鼻咽癌CNE细胞在EGCG(60、80、100mg/L)分别单独以及联合17-AAG(0.625μmol/L)作用48h,Bax、Bcl-2蛋白表达的变化。9.统计学处理,采用SPSS 22.0软件进行统计分析,以P0.05为差异具有统计学意义。实验结果:1.MTT比色法检测药物抑制效应:17-AAG(0.315、0.625、1.25、2.5、5μmol/L)作用于人鼻咽癌CNE细胞24h、48h和72h,EGCG(40、60、80、100mg/L)作用于人鼻咽癌CNE细胞24h、48h和72h.均对人鼻咽癌CNE细胞有抑制作用,其抑制作用与时间和剂量相关,差异具有统计学意义(P0.01)。17-AAG(0.625μmol/L)和EGCG(40、60、80、100mg/L)两者联合使用呈现抑制效果的显著增加,且与EGCG的浓度和作用时间的正相关,差异具有统计学意义(P0.01)。2.光学显微镜、荧光显微镜(Hoechst 33258荧光染色、A0荧光染色、A0/EB荧光双染色后)下观察细胞形态的变化:随着药物浓度的增加细胞形态不规则随之增多、染色质浓缩、核固缩、凋亡小体、自噬泡等也增多,对照组的细胞形态良好。3.用流式细胞术(FACS)分析检测人鼻咽癌CNE细胞的周期:不同浓度17-AAG和EGCG单独及联合用药48h,经FACS分析结果显示,单独用药时17-AAG阻滞人鼻咽癌CNE细胞主要在S期,EGCG阻滞人鼻咽癌CNE细胞主要在G2/M期,17-AAG和EGCG联合用药时阻滞人鼻咽癌CNE细胞主要在G2/M期和S期,差异具有统计学意义(P0.01)。4.Annexin V-FITC/PI双染法检测人鼻咽癌CNE细胞凋亡率的变化:17-AAG(0.625μmol/L)、EGCG(40mg/L)单独及联合用药48h,经FACS分析结果显示,联合用药组比单独用药组的CNE细胞凋亡率高,差异具有统计学意义(P0.01)。5.RT-PCR法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3的m RNA表达:分别选取EGCG(80mg/L)、17-AAG(0.625μmol/L)单独以及联合作用于人鼻咽癌CNE细胞48h,Caspase-3和Bax的m RNA表达,联合用药时明显高于单独用药时,并且Bcl-2的m RNA表达联合用药时明显低于单独用药时。6.用Western Blotting检测Bax、Bcl-2蛋白表达的变化:分别选取EGCG(40、60、80、100mg/L),17-AAG(0.625μmol/L)单独以及联合作用于人鼻咽癌CNE细胞48h,17-AAG和EGCG联合用药时Bax蛋白的表达明显高于单独用药时,17-AAG和EGCG联合用药时Bcl-2蛋白的表达也明显低于单独用药。实验结论:作为新型的抗肿瘤药物,17-AAG和EGCG单独及联合均能有效抑制人鼻咽癌CNE细胞的体外增殖,联合使用时抑制效果更加明显呈现抑制协同,作用均呈时间和剂量的依赖性。其作用机制可能与上调Bax和Caspase-3、下调Bcl-2的表达有关。
【关键词】：人鼻咽癌 EGCG 热休克蛋白 17-AAG
【学位授予单位】：延安大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-12
• 前言12-16
• 实验材料16-22
• 1.细胞株16
• 2.主要试剂16-17
• 3.主要仪器17-19
• 4.试剂配制19-22
• 实验方法22-32
• 1.细胞培养22-23
• 2.MTT法检测细胞增殖抑制率23-24
• 3.显微镜下观察 17-AAG、EGCG单独及联合作用下CNE细胞形态变化24-25
• 4.Hoechst 33258荧光染色法观察 17-AAG、EGCG单独及联合作用下CNE细胞形态变化25
• 5.利用吖啶橙(A0)荧光染色法观察在 17-AAG联合EGCG作用下CNE细胞形态变化25-26
• 6.吖啶橙(A0)/溴化乙锭(EB)荧光双染色法观察 17-AAG、EGCG单独及联合作用下CNE细胞形态变化26-27
• 7.流式细胞术检测细胞周期27
• 8.Annexin V- FITC/PI双染法检测细胞凋亡率的变化27-28
• 9.RT-PCR法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表达28-29
• 10.Western Blotting检测检测Bax、Bcl-2 蛋白表达的变化29-31
• 11.统计学处理31-32
• 实验结果32-54
• 1.MTT法检测细胞增殖抑制率32-37
• 2.显微镜下观察 17-AAG、EGCG单独或联合作用下CNE细胞形态变化37-39
• 3.荧光显微镜下观察 17-AAG、EGCG单独或联合作用下CNE细胞形态变化39-45
• 4.流式细胞术分析细胞周期的变化45-48
• 5.Annexin V- FITC/PI双染法检测细胞凋亡率的变化48-50
• 6.RT-PCR法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表达50-51
• 7.Western Blotting检测Bax、Bcl-2 蛋白表达的变化51-54
• 讨论54-60
• 结论60-61
• 参考文献61-70
• 综述70-79
• 参考文献75-79
• 致谢79-80
• 攻读硕士期间发表论文80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 庞丹梅;邓燕明;卫光宇;;局部晚期鼻咽癌同步放化疗单药与联合方案的疗效对比[J];实用医学杂志;2010年01期

  本文关键词：热休克蛋白抑制剂对人鼻咽癌细胞增殖和凋亡的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：453510