中间纤维蛋白vimentin突变体E151K病理机制的分析

发布时间：2017-08-03 10:40

  本文关键词：中间纤维蛋白vimentin突变体E151K病理机制的分析

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【摘要】：波形蛋白vimentin是脊椎动物进化过程中高度保守的一类III型中间纤维(IF)蛋白质,它与微管微丝共同构成细胞的骨架结构,对于支持和锚定细胞器的位置具有重要作用,参与构成细胞衔接和调节细胞粘附及细胞迁移。遗传性白内障是眼睛致盲的重要原因之一,造成遗传性白内障突变的基因包括编码晶状体结构蛋白,转录因子,膜蛋白和离子通道蛋白等一系列基因。已有研究表明,细胞骨架中间纤维蛋白vimentin编码基因中的G596A点突变产生E151K的无义突变蛋白质并导致白内障。究其机理,此突变导致vimentin骨架蛋白组装紊乱,细胞骨架结构改变,从而引发白内障,但是这一突变为何能导致vimentin蛋白组装紊乱目前尚不清楚。SUMO是类泛素小分子蛋白,它在一系列连接酶的作用下,结合到其它蛋白质上,称为蛋白质SUMO化,是一种翻译后重要的修饰方式,能调节一系列的细胞生理过程,包括蛋白质与蛋白质相互作用,亚细胞器定位,蛋白质与DNA作用以及酶活性调节。本实验室对SUMO化调节眼睛发育,特别是晶状体的发育有深入的研究,我们的工作证实在眼睛发育过程中,P32kd PAX6能够被SUMO化,从而激活其DNA结合能力,调控下游基因表达。同时我们还发现SUMO1介导的SUMO化能增强SP1的调节功能从而正向调节细胞分化,而SUMO2/3则通过SP1转录因子的SUMO化而抑制细胞的分化。鉴于vimentin E151K突变产生一个十分保守的SUMO化位点,我们推测vimentin E151K突变引起的白内障是由于在E151K位点产生了SUMO化而抑制它的聚合,从而阻碍细胞骨架的正常结构和功能。我们小组周璐的工作主要是成功构建了pCI-neo-vimentin表达载体和p CI-neo-E151K-vimentin表达载体,并且建立了野生型和E151K突变型转化的稳定细胞系。在此工作基础之上,由于野生型vimentin中存在潜在的两个SUMO化位点,K313和K373,由此我成功构建了pCI-neo-K313R-vimentin表达载体,pCI-neo-K373R-vimentin表达载体,pCI-neo-K313R/K373R-vimentin双突变表达载体,pCI-neo-K313R/K373R/E151K-vimentin三突变表达载体。通过使用脂质体转染试剂作为介导分子,把双突变型、三突变型vimentin表达载体转入晶状体上皮细胞α-TN4-1系,在G418药物筛选下,成功获得了表达双突变型,三突变型转化的稳定细胞株。通过使用西方杂交和免疫荧光技术,对稳定克隆进行了鉴定,并挑出了表达相当的克隆用于进一步实验。对比野生型和突变型,双突变型和三突变型转化的细胞株vimentin的表达水平,SUMO化状态和细胞形态结果,初步推断E151K被SUMO化,造成其聚合受阻,因此导致白内障发生。我们的工作首次阐明了vimentin E151K突变造成白内障的分子机制。
【关键词】：细胞骨架 波形蛋白 晶体细胞α-TN4-1 蛋白质SUMO化 E151K E151K/K313R/K373R
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R776.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1 前言11-22
• 1.1 中间纤维 (Intermediate Filaments)11
• 1.2 波形蛋白vimentin11-16
• 1.2.1 vimentin的结构11-13
• 1.2.2 vimentin的去组装13-14
• 1.2.3 vimentin的功能与疾病14-16
• 1.3 类泛素化蛋白SUMO16-21
• 1.3.1 SUMO化酶促过程17-19
• 1.3.2 SUMO化的去除19-20
• 1.3.3 SUMO化的功能20-21
• 1.3.4 SUMO与泛素化蛋白酶体相互作用21
• 1.4 本课题研究背景21-22
• 2 实验材料和方法22-37
• 2.1 实验材料与试剂22-23
• 2.1.1 材料与试剂22
• 2.1.2 仪器设备22-23
• 2.2 实验方法23-37
• 2.2.1 小鼠vimentin cDNA的克隆23-26
• 2.2.2 pCI-neo-K313R-vimentin，，p CI-neo-K373R-vimentin表达载体的构建26-31
• 2.2.3 p CI-neo-K313R/K373R-vimentin表达载体的构建31-32
• 2.2.4 p CI-neo-K313R/K373R/E151K-vimentin表达载体的构建32
• 2.2.5 脂质体转染α-TN4-1 细胞系32-35
• 2.2.6 免疫荧光爬片技术35-37
• 3 实验结果和讨论37-43
• 3.1 实验结果37-42
• 3.1.1 pCI-neo-K313R-vimentin，p CI-neo-K373R-vimentin表达载体的鉴定37-38
• 3.1.2 p CI-neo-K313R/K373R-vimentin表达载体的鉴定38-39
• 3.1.3 p CI-neo-K313R/K373R/E151K-vimentin表达载体的鉴定39-40
• 3.1.4 转染野生型和E151K型细胞的免疫荧光结果40-41
• 3.1.5 转染双突变型和三突变型细胞的免疫荧光结果41-42
• 3.2 讨论与展望42-43
• 参考文献43-51
• 硕士期间发表的论文情况51-52
• 致谢52-53

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4 王

本文编号：613977