视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞对视网膜色素上皮影响的实验研究

发布时间：2017-08-11 07:03

  本文关键词：视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞对视网膜色素上皮影响的实验研究

  更多相关文章： 视网膜色素上皮细胞 细胞培养 外路视网膜下细胞移植 氧诱导病变小鼠模型 干细胞研究进展

【摘要】：研究背景许多视网膜疾病,如早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity, ROP)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)、糖尿病性视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)等都会引起视网膜细胞的死亡,从而导致不可逆的视力丧失。目前对于此类疾病,临床上仍无有效的治疗方法,可采用的方法有视网膜光凝、冷凝、手术、抗炎治疗、神经营养支持等,但其临床疗效并不显著,难以恢复患者的受损视力。近年来,随着国内外研究者对干细胞的不断深入研究,视网膜细胞的再生和功能重建已成为炙手可热的话题,干细胞移植治疗为视网膜疾病患者带来了新的希望,也引起广大眼科临床工作者的关注。干细胞是指生物个体生长发育的原始细胞,同时具有自我复制和多向分化潜能的细胞,目前用于科研研究的主要是胚胎干细胞。胚胎干细胞(embryon ic stem cell, ESCs)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞,它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境,ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。目前用于治疗视网膜疾病的眼源性干细胞主要包括源于视网膜的干细胞和前体细胞、Mul ler细胞、虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelium, IPE)和视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)。视网膜色素上皮是由单层色素上皮细胞所构成,排列十分规则。细胞呈多角形,细胞分为三部分,即顶部、体部和基底部。RPE细胞对视网膜的营养及维持光感受器细胞的正常功能起到重要作用,如传递光感受器新陈代谢所需的物质、参与维生素A代谢、构成视网膜外屏障、参与眼球的发育、屈光不正的发生发展及生长因子的产生等。RPE细胞在许多视网膜疾病如ROP、AMD、DR的发生发展中起到重要作用,目前临床上用于修复此类视网膜损伤疾病主要有手术、视网膜光凝、抗VEGF药物等方法,但临床疗效不佳,难以恢复患者的受损视力,RPE细胞移植给此类视网膜损伤疾病的治疗带来的新的方向。我们对小鼠RPE细胞分离、培养及视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞进行实验研究,同时讨论胚胎干细胞及几种主要的眼源性干细胞在眼科领域的应用进展展开讨论,现将结果报告如下。目的观察视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞对小鼠视网膜色素上皮层的影响。方法1.体外分离、培养及冻存小鼠视网膜色素上皮细胞：取C57BL/6小鼠10只,脊髓脱臼法处死小鼠,取出眼球,清洗、去除眼前段组织后将眼杯泡在清洗液,用镊子轻轻挑起膨胀的视网膜神经上皮层,用显微剪在视盘表面去除视网膜神经上皮层,清洗后使用胰蛋白酶溶液消化,消化完成后用微量注射器轻轻吹打眼杯内表面,收集含黑色素颗粒的培养液,常规离心后接种于培养瓶中,放入培养箱中培养。完成取材后每天显微镜下观察细胞生长情况,2-3天更换一次培养液,细胞贴壁后隔天换液,当细胞融合度达约90%时,记录所用时间,并按1：4的比例传代。传代后依旧每天显微镜下观察细胞生长情况,2-3天更换一次培养液。取第1、4代小鼠RPE细胞,消化后细胞计数,接种于24孔板,置于培养箱中培养,每日取3孔细胞进行计数,取平均值绘制生长曲线。将第1代的小鼠RPE细胞接种于24孔培养板中,3d后取出洗涤,冰丙醇固定,自然干燥后密闭保存,细胞爬片经漂洗后用过氧化物酶以消除内源性过氧化物酶活性,再次洗涤,然后加入鼠抗人RPE65蛋白一抗,孵育、漂洗后加入大鼠抗山羊以及山羊抗兔二抗,孵育、漂洗,二氨基联苯胺显色,置于显微镜下观察,若胞浆呈现棕黄色则为阳性,否则为阴性。空白对照组用PBS液代替一抗作阴性对照。第4代小鼠RPE细胞生长至细胞融合度达约90%时,即可行细胞冻存,配制20%胎牛血清加8%二甲基亚砜的冻存液,将细胞用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,同时计数,常规离心、重悬沉淀后移入冻存管,放入泡沫盒内,直接放入-80℃冰箱冻存以备后续实验行细胞复苏后使用。2.小鼠视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞：从.80℃冰箱中取出冰冻的小鼠RPE细胞冻存管,解冻后将细胞转移至含RPE细胞培养液的离心管中混匀,常规离心、吸弃上清液后重悬细胞沉淀,转移悬浮液至培养瓶中,补加小鼠RPE细胞培养液至6 ml。复苏后小鼠视网膜色素上皮细胞状态不稳定,需传代2次后再行视网膜下腔移植,当细胞融合度约达90%时传代,洗涤、消化后显微镜下观察到细胞变圆,有细胞开始脱离瓶壁时,停止消化。离心、重悬沉淀后按照1：8的比例传代至新的培养瓶中,轻轻摇匀后移入培养箱中。小鼠RPE细胞传代2次后显微镜下观察,当细胞融合度达90%以上时,用胰蛋白酶消化,离心重悬细胞沉淀后加入培养液混匀,制备成约1×106个/ml浓度的小鼠RPE细胞悬浮移植液。将30只7日龄C57BL/6J新生小鼠分成正常组、氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy, OIR)模型组及OIR模型细胞移植组,每组10只。OIR模型组及OIR模型细胞移植组建立OIR模型：将小鼠与母鼠共同置于氧浓度(75±2)%的氧箱内,箱内温度(23±2)℃,每天日光照射12h,饲养5d后转移至正常环境中饲养5 d。正常组小鼠与母鼠共同置于密闭箱内,温度(23±2)℃,每天日光照射12 h,饲养5 d。对OIR模型细胞移植组小鼠行外路视网膜下腔移植手术。腹腔麻醉小鼠,切开眼球上方结膜少许,暴露巩膜,用显微铲针刺穿前房放出少许房水,在角膜缘后2mm处用显微注射器向着眼球后方稍平行巩膜斜向刺入球壁,注入细胞液,同样术式处理OIR模型组小鼠,注射小鼠RPE细胞培养液,术毕涂红霉素眼膏以防止感染。采用荧光显微镜观察各组小鼠RPE层的变化。取各组小鼠行视网膜冰冻切片,固定、脱水、包埋,切片后置于湿盒内,加入1：50稀释的荧光标记RPE65,冲洗后,加入辣根过氧化物酶二抗,孵育、冲洗、染核、漂洗后转移至载玻片上,避光自然晾干,盖上盖玻片荧光显微镜下观察并拍照。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠RPE细胞RPE65、Bestrophin、ZO-1蛋白相对表达量。采用RT-PCR检测各组小鼠RPE细胞RPE65、Bestrophin、ZO-1 mRNA相对表达量。结果1.初分离的原代小鼠RPE细胞镜下可见胞体呈圆形,梭形,不规则形,内含丰富的黑色素颗粒,未见细胞核,12h后大部分细胞贴壁,贴壁细胞可见清晰的细胞核,4d后细胞融合成单层生长。传代后第1代细胞活力较强,2-3d后细胞融合,形态多呈梭形及不规则形,黑色素颗粒较多,但对比原代细胞明显变淡,第4代细胞,黑色素颗粒较少,细胞渐趋透明。生长曲线结果表明第1、4代小鼠视网膜色素上皮细胞均在第3d进入细胞对数生长期,4-5d生长显著,随后进入稳定期,其中第1代小鼠视网膜色素上皮细胞生长速度稍快于第4代。第1代小鼠视网膜色素上皮细胞经免疫细胞化学检测RPE65蛋白显示小鼠视网膜色素上皮细胞呈阳性反应,细胞胞浆内呈棕黄色,空白对照组呈阴性。2.荧光显微镜观察发现,正常组小鼠RPE层呈结构整齐的单层排列,OIR模型组小鼠RPE层连续性中断,排列紊乱,部分位置缺失RPE细胞,OIR模型细胞移植组小鼠RPE层明显增厚,呈多层排列,结构整齐,细胞存活良好。Western blot检测结果显示,正常组、OIR模型组、OIR模型细胞移植组RPE65蛋白相对表达量分别为123.750±6.752、100.000±15.492、124.000±5.292；Bestrophin蛋白相对表达量分别为95.250±15.414、52.750±15.392、109.000±20.833；ZO.1蛋白相对表达量分别为93.750±6.946、93.500±6.807、83.500±8.583。统计学分析结果示,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐性检验p0.05,F=7.272、2.438、11.358,多组间差异RPE65蛋白、Bestrophin蛋白有统计学意义,p0.05,而Zo-1蛋白无统计学差异。组间多重比较采用LSD-t检验,其中RPE65蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p0.05。Bestrophin蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p0.05。ZO-1蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p0.05。RT-PCR检测结果显示,正常组、OIR模型组、OIR模型细胞移植组RPE65 mRNA相对表达量分别为0.895±0.118、0.393±0.123、0.928±0.169；Bestrophin mRNA相对表达量分别为0.818±0.161、0.317±0.120、0.735±0.278；ZO-1 mRNA相对表达量分别为0.841±0.151、0.391±0.103、0.883±0.176。使用spss 19.0统计学软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐性检验均p0.05,F=28.155、20.769、11.066,多组间差异有统计学意义,p0.05,组间多重比较采用LSD-t检验,其中RPE65蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p0.05。Bestrophin蛋白相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p0.05。ZO-1蛋白相对表达量,各组间均无统计学差异,p0.05。结果显示RPE65、Bestrophin蛋白相对表达量正常组、OIR模型细胞移植组均比OIR模型组增高,而OIR模型组细胞移植组与正常组无统计学差别；ZO.1蛋白相对表达量各组间均无统计学差异。RT-PCR检测结果显示,正常组、OIR模型组、OIR模型细胞移植组RPE65 mRNA相对表达量分别为0.895±0.118、0.393±0.123、0.928-0.169；Bestrophin mRNA相对表达量分别为0.818±0.161、0.317±0.120、0.735±0.278；Zo-1 mRNA相对表达量分别为0.841±0.151、0.391±0.103、0.883±0.176。使用spss 19.0统计学软件进行分析,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐性检验均p0.05,F=28.155、20.769、II.066,多组间差异有统计学意义,p0.05,组间多重比较采用LSD-t检验,其中RPE65 mRNA相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p0.05。Bestrophin mRNA相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p0.05。ZO-1 mRNA相对表达量,正常组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,OIR模型细胞移植组与OIR模型组间差异有统计学意义p0.05,而OIR模型细胞移植组与正常组间差异无统计学意义,p0.05。结论1.改良酶消化法可以成功体外分离、培养及冻存小鼠RPE细胞,细胞纯度高、贴壁率高、细胞活力较强,为后续实验提供了细胞来源。2.视网膜下腔移植RPE细胞可促进小鼠视网膜色素上皮层增殖,RPE层明显增厚,呈多层排列,结构整齐,细胞存活良好。通过对RPE65、Zo-1、Bestrophin三种蛋白和基因的检测发现,视网膜下腔移植RPE细胞可以增强调控维生素A的反式.顺式异构化能力及细胞吞噬能力,移植细胞的生物学功能得以发挥,而移植细胞与原宿主细胞的紧密连接的形成尚不充分。
【关键词】：视网膜色素上皮细胞 细胞培养 外路视网膜下细胞移植 氧诱导病变小鼠模型 干细胞研究进展
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R774.1
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 第一部分 小鼠视网膜色素上皮细胞的分离与培养19-27
• 1. 前言19-20
• 2. 材料与方法20-22
• 3. 结果22-24
• 4. 讨论24-25
• 小结25-27
• 第二部分 视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞对小鼠视网膜色素上皮层的影响27-43
• 1. 前言27-28
• 2. 材料与方法28-32
• 3. 结果32-39
• 4. 讨论39-42
• 小结42-43
• 全文总结43-44
• 参考文献44-49
• 综述49-58
• 参考文献54-58
• 攻读学位期间发表论文58-59
• 致谢59-61

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 盛丽娜;;一种新的研究视网膜色素上皮移植的兔模型[J];眼科新进展;2009年03期

2 周家宝;王秋霞;;视网膜色素上皮的类脂样变性[J];国外医学.眼科学分册;1982年02期

3 陈恩平;邱梅英;;视网膜色素上皮撕裂[J];国外医学.眼科学分册;1985年02期

4 李润春，王竞，刘剑;先天性视网膜色素上皮肥大对家族性腺瘤性息肉病的筛查[J];中华眼底病杂志;1995年01期

5 贾万程,侯俭,崔凡明;视网膜色素上皮失代偿18例[J];中华眼底病杂志;1996年03期

6 ;视网膜色素上皮的功能[J];国外医学.眼科学分册;1997年05期

7 贾万程,刘筠,左全义;视网膜色素上皮失代偿与中心性浆液性脉络膜视网膜病变关系探讨[J];济宁医学院学报;1997年02期

8 杜红俊;视网膜色素上皮与新生血管的形成[J];眼科研究;1998年02期

9 贾万程;视网膜色素上皮炎质疑[J];济宁医学院学报;2000年03期

10 李光辉,高汝龙;视网膜色素上皮移植失败原因分析[J];眼科新进展;2000年01期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 李瑞峰;杨荣;李成泉;;视网膜色素上皮对吲哚青绿血管造影晚期像的影响[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

2 付小玻;张晓梅;王业青;马鸿梅;李伟军;林英;冯卓蕾;;兔视网膜色素上皮细胞培养、纯化和鉴定[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

3 魏文斌;;视网膜色素上皮肿瘤[A];中国眼底病论坛·全国眼底病专题学术研讨会论文汇编[C];2008年

4 银红梅;王宜强;宫华青;杨玲玲;;尼古丁对视网膜色素上皮细胞的影响[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

5 孙祖华;刘晓玲;林冰;袁一民;李英姿;董徐洁;;不同类型视网膜色素上皮病变的自身荧光表现[A];中国眼底病论坛·全国眼底病专题学术研讨会论文汇编[C];2008年

6 文峰;;视网膜色素上皮损害的眼底血管造影分析[A];中国眼底病论坛·全国眼底病专题学术研讨会论文汇编[C];2008年

7 胡运韬;马志中;张陶然;吴建国;李颖;;片状自体视网膜色素上皮移植的组织形态学观察[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

8 董方田;戴荣平;;手术治疗视网膜和视网膜色素上皮联合错构瘤[A];中国眼底病论坛·全国眼底病专题学术研讨会论文汇编[C];2008年

9 俞笳;黎蕾;徐格致;沈颖;高巧云;姜春晖;;视网膜和视网膜色素上皮联合错构瘤[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

10 陈松;崔兰君;马修彬;李文博;;蓝光诱导猪视网膜色素上皮细胞复制衰老的实验研究[A];中国眼底病论坛·全国眼底病专题学术研讨会论文汇编[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前3条

1 黄文婧;国内首创人视网膜色素上皮干细胞注射液[N];科技日报;2005年

2 胡运韬;超薄植片带来光明希望[N];健康报;2006年

3 王充;困扰老人的黄斑出血[N];人民政协报;2003年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 吴畏;组织工程化人视网膜色素上皮复合体的研究[D];第三军医大学;2016年

2 徐海峰;高糖对视网膜色素上皮屏障与转运功能的影响[D];青岛大学;2005年

3 韩伟;花背蟾蜍（Bufo raddei Strauch）眼早期发育过程中细胞凋亡和分子分化的研究[D];兰州大学;2012年

4 崔极哲;转化生长因子-β1基因修饰的人视网膜色素上皮细胞移植治疗老年性黄斑变性的实验研究[D];吉林大学;2005年

5 庞东渤;维拉帕米诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡过程中信号转导的研究[D];中国医科大学;2006年

6 生晖;视网膜色素上皮蓝光损伤及蓝光滤过型人工晶状体保护作用的研究[D];复旦大学;2005年

7 荣军博;全反式视黄酸（atRA）对人视网膜色素上皮（RPE）屏障功能影响的研究[D];中南大学;2011年

8 王沙;视黄酸对豚鼠近视眼视网膜色素上皮—脉络膜复合体作用的相关研究[D];中南大学;2014年

9 王洁月;DAT对豚鼠形觉剥夺性近视眼视网膜色素上皮bFGF表达作用的研究[D];中南大学;2010年

10 张陶然;带部分脉络膜的自体视网膜色素上皮移植对损伤的感光细胞保护作用的实验研究[D];北京大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 秦贤杰;靶向PDGFR-α的RNA干扰对体外视网膜色素上皮细胞增殖和凋亡的影响[D];桂林医学院;2015年

2 赵立宇;视网膜下腔移植视网膜色素上皮细胞对视网膜色素上皮影响的实验研究[D];南方医科大学;2016年

3 王立春;实验性视网膜色素上皮变性模型的建立及异体视网膜色素上皮细胞移植的初步研究[D];河北医科大学;2006年

4 杨娟;视网膜色素上皮细胞增殖与抑制实验及移植研究[D];福建医科大学;2004年

5 李春晖;碱性成纤维细胞生长因子对兔视网膜色素上皮细胞凋亡的影响[D];山西医科大学;2004年

6 高妍;视网膜色素上皮移植对视网膜光损伤修复的实验研究[D];山西医科大学;2004年

7 徐静;热休克预处理对视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响[D];青岛大学;2006年

8 张嘉声;几丁糖和透明质酸钠对兔视网膜色素上皮细胞增殖影响的实验研究[D];华中科技大学;2006年

9 闫利锋;可见光诱导体外培养兔视网膜色素上皮细胞凋亡的实验研究[D];山西医科大学;2004年

10 高洁;急性中心性浆液性脉络膜视网膜病变的频域光学相干断层扫描图像特征研究[D];中国协和医科大学;2009年

，

本文编号：654736