介孔二氧化硅纳米载体介导南蛇藤素抗喉癌作用的研究

发布时间：2017-08-14 03:17

  本文关键词：介孔二氧化硅纳米载体介导南蛇藤素抗喉癌作用的研究

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【摘要】：背景:喉癌是头颈部常见的肿瘤之一,近年来,其发病率有逐渐上升的趋势。目前,临床治疗喉癌的首选方法是手术治疗,但易造成喉功能丧失;喉癌对化疗敏感性低,易产生多药耐药;放疗毒副作用大。因此,迫切寻找更高效的治疗方法。传统中药材雷公藤被用于治疗自身免疫病、慢性炎症、哮喘和慢性神经性疾病已有几百年的历史。近来,人们发现从雷公藤根部提取出来的一种三萜类化合物南蛇藤素,能抑制多种肿瘤细胞系的增殖能力。然而,南蛇藤素的水溶性极低,口服生物利用度不高;对肿瘤细胞的特异性选择差,有效治疗剂量与中毒剂量非常接近;这些缺点限制了南蛇藤素作为抗肿瘤药物的临床应用。新型纳米药物递送体为解决以上难题提供了新的思路,其中介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)载体因其无毒、良好的生物相容性和可生物降解性,被国、内外学者推崇为药物递送研发平台的极佳载体。本课题拟构建负载有南蛇藤素的介孔二氧化硅纳米粒子载药系统(MSNs-celastrol),通过对比南蛇藤素裸药(celastrol),研究MSNs装载南蛇藤素的理化特征以及MSNs-celastrol对人喉癌HEp-2细胞体内、外的抗肿瘤效果。方法:1.通过化学合成介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)载体,应用透射电镜和扫描电镜对MSNs的粒径、结构、分散性等理化性质进行计算与分析。2.用3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)将MSNs的骨架结构修饰氨基,增强了MSNs载体与南蛇藤素分子结构的羧基间静电相互吸引能力,提高MSNs对南蛇藤素的负载效率和载药量。用紫外分光光度计测定初始南蛇藤素浓度和未负载入MSNs载体的南蛇藤素浓度,通过差量法计算MSNs装载南蛇藤素的载药效率和载药量;为模拟体内血液环境,用胎牛血清(FBS)作为MSNs-celastrol释放南蛇藤素的释放介质,进行体外药物释放实验。3.通过体外实验,探讨南蛇藤素裸药和MSNs-celastrol载药系统对人喉癌HEp-2细胞的细胞活力、周期、自噬和凋亡的影响;通过体内实验建立人喉癌HEp-2细胞的移植瘤模型,分析南蛇藤素裸药和MSNs-celastrol载药系统对裸鼠移植瘤的治疗效果。4.通过western blot探讨MSNs-celastrol抑制喉癌生长的分子机制。5.通过体外CCK-8实验检测不同浓度的MSNs载体对HEp-2细胞的细胞毒性;体内动物实验:观察负载南蛇藤素的MSNs载体在治疗喉癌移植瘤过程中对小鼠饮食、活动、精神状态的影响,监测荷瘤小鼠体重变化,HE染色观察治疗结束后小鼠主要脏器的组织学变化,评估MSNs载体的生物相容性。结果:1.MSNs的合成及表征TEM结果显示:合成的MSNs有许多排列有序的孔道;SEM结果显示:合成的MSNs呈较均匀规整的球形,分散性好;动态光散射(DLS)粒径分析结果显示:MSNs的粒径为30nm±2.2nm。2.载药量及药物释放率的测定MSNs因具有巨大比表面积和高比孔容性,可将南蛇藤素负载在其孔道内,但初试结果显示MSNs负载南蛇藤素效率不高。为增加与南蛇藤素载药量,我们用3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)对介孔硅纳米粒子结构骨架进行氨基修饰,结果药物包封率达50%±3.4%,载药量2.5%。体外药物释放实验显示MSNs-celastrol载药系统具有良好的药物缓释效果:4h内南蛇藤素累积释放率为22%左右,未出现暴释效应,满足中国药典的规定;24h~96h药物呈缓慢持续释放,100h以后药物释放达80%,药物释放基本完全。3.MSNs-celastrol载药系统抗肿瘤作用评价体外实验结果显示:在相同的药物浓度下,MSNs-celastrol载药系统比南蛇藤素裸药对HEp-2细胞的生长抑制更显著,导致HEp-2细胞周期阻滞在G2/M期,具有诱导细胞自噬和凋亡作用。体内实验显示:MSNs-celastrol载药组和南蛇藤素裸药组对荷瘤裸鼠的抑瘤率分别为82.6%和78.5%;然而,南蛇藤素裸药组的小鼠体重相对给药前减少9.7%,对照组和MSNs-celastrol载药组小鼠体重分别增加17.8%和4.5%。荷瘤裸鼠肿瘤组织免疫组化结果显示:相对等剂量南蛇藤素裸药组,MSNs-celastrol载药组小鼠肿瘤组织中的Ki67阳性细胞率更低,TUNEL阳性率更高。4.MSNs-celastrol载药系统抗肿瘤机制的研究体外实验:将MSNs-celastrol作用于HEp-2细胞,Western blot实验结果表明MSNs负载的南蛇藤素对内质网应激相关蛋白、凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白在HEp-2细胞内的表达具有明显的诱导作用。同样裸鼠肿瘤组织蛋白的Western blot结果显示MSNs-celastrol载药组小鼠肿瘤组织凋亡相关蛋白、内质网应激相关蛋白、自噬相关蛋白表达亦增强,与体外实验结果相符。5.MSNs生物相容性分析体外CCK-8实验显示不同浓度(31~250μg/m L)的MSNs并不影响肿瘤细胞的活力,体内实验MSNs负载的南蛇藤素低浓度组(MSNs的浓度为20mg/kg)和MSNs负载的南蛇藤素高浓度组(MSNs的浓度为35mg/kg)在治疗过程中,并未使裸鼠的体重减轻。HE染色结果显示:注射MSNs-cel.1.75mg/kg组和对应的MSNs载体组的小鼠各脏器内均未观察到炎症细胞浸润和细胞损伤的形态学变化。提示MSNs-celastrol的生物学作用是负载的南蛇藤素引起的,并且在MSNs所使用的剂量范围和时间内,我们没有发现MSNs本身对机体引起任何损伤。结论:1.成功合成粒径30nm左右,分散性好,稳定性较高,可装载并缓释南蛇藤素的MSNs载体。2.MSNs具有较好的生物相容性。3.构建的MSNs-celastrol载药系统增强南蛇藤素靶向性,提高了南蛇藤素的生物利用度,增强了南蛇藤素抗肿瘤作用,同时,降低了南蛇藤素的毒副作用;这种抗肿瘤作用是通过增强内质网应激介导细胞自噬和凋亡。
【关键词】：喉癌 疏水性 南蛇藤素 介孔二氧化硅纳米粒子 药物递送体
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.65
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-15
• 第1章 绪论15-24
• 1.1 南蛇藤素药理作用的研究现状15
• 1.2 提高南蛇藤素水溶性的方法15-16
• 1.3 MSNS作为新型纳米药物递送载体的研究16-20
• 1.3.1 MSNs的合成16-18
• 1.3.2 MSNs作为纳米药物递送体的优点18
• 1.3.3 MSNs作为药物载体的发展进程18-20
• 1.4 MSNS作为新型药物递送系统面临的挑战20-22
• 1.5 本论文的研究目的及思路22-24
• 第2章 实验部分24-34
• 2.1 实验材料24-25
• 2.2 实验方法25-34
• 2.2.1 MSNs的合成25
• 2.2.2 MSNs形态和尺寸表征25-26
• 2.2.3 荧光标记MSNs26
• 2.2.4 细胞对F-MSNs的内吞过程26
• 2.2.5 流式细胞术检测细胞内F-MSNs的荧光强度26-27
• 2.2.6 MSNs载药和释药测定27-28
• 2.2.7 透射电镜观察MSNs在细胞内的分布28
• 2.2.8 CCk-8 检测细胞活性28-29
• 2.2.9 流式细胞仪检测细胞周期29
• 2.2.10 AnnexinV/PI检测细胞凋亡29
• 2.2.11 western blot检测蛋白的表达情况29-30
• 2.2.12 裸鼠皮下移植瘤模型建立30
• 2.2.13 分组及给药治疗30
• 2.2.14 组织学分析30-32
• 2.2.15 Western blot检测肿瘤组织相关抗原的表达32
• 2.2.16 ICP-AES检测MSNs在小鼠体内的分布32-33
• 2.2.17 数据分析33-34
• 第3章 结果34-50
• 3.1 MSNS的合成34
• 3.2 MSNS的表征34
• 3.3 MSNS的粒径分析34-35
• 3.4 MSNS载药量及药物释放率的测定35-36
• 3.5 MSNs-celastrol体外抗肿瘤效果评价36-40
• 3.5.1 MSNs-celastrol对HEp-2 细胞活力的影响36-37
• 3.5.2 MSNs-celastrol对HEp-2 细胞细胞周期的影响37-38
• 3.5.3 MSNs-celastrol诱导HEp-2 细胞凋亡38-39
• 3.5.4 MSNs-celastrol诱导HEp-2 细胞自噬39-40
• 3.6 MSNs-celastrol体外抗肿瘤作用机制的研究40-43
• 3.6.1 细胞对MSNs的摄取40-42
• 3.6.2 透射电镜观察MSNs在细胞的定位42
• 3.6.3 内质网应激水平检测42-43
• 3.7 MSNs-celastrol治疗裸鼠移植瘤的效果评价43-48
• 3.7.1 荷瘤裸鼠肿瘤生长情况及体重变化的监测43-45
• 3.7.2 荷瘤裸鼠肿瘤细胞的增殖和凋亡情况45-46
• 3.7.3 荷瘤裸鼠肿瘤组织内质网应激水平检测46-48
• 3.8 MSNS的组织相容性分析48
• 3.9 MSNS在小鼠体内的分布48-50
• 第4章 讨论50-56
• 4.1 MSNs-celastrol能发挥更高效抗肿瘤作用51-53
• 4.2 MSNs-celastrol降低南蛇藤素毒副作用53-54
• 4.3 MSNS具有较好的生物相容性和生物可降解性54-56
• 第5章 结论56-57
• 参考文献57-62
• 作者简介及硕士期间研究成果62-63
• 致谢63

【参考文献】

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本文编号：670474