一个中国LHON大家系中新核修饰因子的发现与鉴定

发布时间：2017-08-14 13:26

  本文关键词：一个中国LHON大家系中新核修饰因子的发现与鉴定

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【摘要】：LHON是一种常见的线粒体母系遗传视神经病变,主要累及视网膜神经节细胞,临床主要表现为双眼同时或先后发生急性或亚急性的视力减退,同时伴有中心视野缺失和色觉障碍,病理改变显现为视盘周围神经纤维层肿胀和毛细血管扩张。线粒体DNA的3个原发性突变(G11778A、G3460A、T14484C)是LHON的主要分子发病基础,却不足以阐明LHON的不完全外显、男性好发等特性,这表明LHON致病还受其它遗传因素、环境因素的影响。不完全外显和男性好发是LHON的两大特性,也是目前亟待解决的难题。我们在研究中发现一个具有高外显率(80%)、较低男女比率(1：1.7)LHON家系(WZ162家系),研究发现mtDNA继发突变及其他相关突变可能对此家系LHON发病无重要作用,我们推测可能存在核基因突变影响此家系LHON高外显率。为寻找与此家系发病相关的核修饰基因,我们选择此家系一名携带者Ⅱ-10,三名患者Ⅱ-1、Ⅲ3、Ⅲ-6进行全基因组外显子测序,并从33例错义突变、9例插入缺失、4例剪切位点突变中筛选出一个核基因突变-PRICKLE3 c.157CT。此突变导致PRICKLE3蛋白第53位高度保守的精氨酸(R)变为色氨酸(W),只存在WZ162家系的患者中,女性患者为杂合突变,男性患者为纯合突变,家系内正常对照及携带者均不含此突变,符合X连锁的显性遗传模式。此外,此突变在筛查436位正常对照和179位来自55个LHON家系的母系成员与105位散发患者中均不存在。再通过Sanger测序对PRICKLE3基因的全外显子区域进行验证,发现除c.157CT外,9个外显子区域均不含其他突变。经过定位分析,我们发现PRICKLE3蛋白部分位于线粒体内,可能与线粒体功能关联。同时它在多种细胞及脑、肝脏、肾脏、肺、胎盘、胰脏等器官广泛表达。为阐明PRICKLE3 c.157 CT突变对线粒体功能的影响,我们构建了来自家系患者、携带者及正常对照的永生化淋巴细胞系,并进行一系列与线粒体功能相关的生化检测。生化检测结果如下：(1)PRICKLE3蛋白表达检测显示粗提线粒体总蛋白中对照组、携带者组、患者组的相对表达量分别为0.90、0.82、0.91,细胞总蛋白中对照组、携带者组、患者组的相对表达量分别为1.11、1.26、1.15,三组相互比较无显著差异(P0.05)。(2)线粒体呼吸链亚基蛋白表达检测显示患者组ATP6亚基的相对表达量显著低于携带者组(P=0.01)和对照组(P=0.05),分别降低了35%、44%；ND4、ND5、ND6、CYTB、CO2亚基相对表达量三组间无显著差异(P0.05)(3)细胞氧耗(OCR)实时测定发现患者组的基础OCR、ATP产能相关OCR、最大呼吸OCR分别比对照组降低了52%、59%、52%(P0.01)；同时与携带者相比,患者组ATP产能相关OCR值下降幅度增大了24%(P0.05)。(4)ATP检测发现,与对照组相比较,患者组氧化磷酸化ATP产量减少了63%(P＜001),携带者组氧化磷酸化ATP产量减少了43%(P=0.05),患者组氧化磷酸化ATP产量的下降幅度增大了20%(P0.01),与患者组ATP6亚基的表达量降低及ATP产能相关OCR值下降幅度增大的结果一致。(5)膜电位检测显示携带者组和患者组线粒体膜电位低于对照组,差异显著(P0.05),但患者组与携带者组相比较,膜电位相似,无显著差异(P0.05)。(6)在H202刺激下,对照组、携带者组、患者组的ROS水平的平均值分别为1.68、2.12、2.55,患者组、携带者组ROS水平提高幅度均显著大于对照组(P0.05)；但患者组与携带者组相比较,ROS水平无明显提高(P0.05)。通过以上检测和分析,我们在WZ162家系发现了一个新的核基因突变位点PRICKLE3 c.157CT。该突变符合X-连锁显性遗传模式,在淋巴细胞系中可促进线粒体ATP的产能降低,可能影响此家系外显率。但PRICKLE3 c.157CT影响线粒体产能、调控LHON发病具体机制还有待于进一步研究。
【关键词】：LHON 外显子测序 PRICKLE3 核修饰因子
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.6
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 1 引言14-28
• 1.1 线粒体与线粒体疾病14-16
• 1.1.1 线粒体的功能及调控14-15
• 1.1.2 线粒体疾病遗传模式及发病特点15-16
• 1.2 LHON的研究现状16-21
• 1.2.1 LHON的发现历史16
• 1.2.2 与LHON相关的原发性突变16-17
• 1.2.3 LHON临床表现及诊治17-18
• 1.2.4 影响LHON发病的因素18-21
• 1.3 二代测序技术与新致病基因的发现21-27
• 1.3.1 第二代测序技术的发展21
• 1.3.2 全基因组外显子测序与致病基因的发现21-23
• 1.3.3 全基因组外显子测序的基本思路及技术路线23-27
• 1.4 本课题的研究思路27-28
• 2 实验材料与方法28-44
• 2.1 临床样本28-29
• 2.1.1 样本来源及细胞株简介28
• 2.1.2 家系谱系28-29
• 2.1.3 临床资料及照片29
• 2.2 研究试剂29-31
• 2.2.1 化学试剂29-30
• 2.2.2 化学试剂试剂盒30
• 2.2.3 抗体30-31
• 2.3 主要仪器及器材31
• 2.4 常用试剂溶液及培养基的配制31-33
• 2.4.1 感受态细胞制备及转化试剂31-32
• 2.4.2 细胞培养基32
• 2.4.3 血液DNA提取所用试32
• 2.4.4 聚丙烯酰胺凝胶贮存液的配制32
• 2.4.5 淋巴细胞建系试剂32
• 2.4.6 OCR测定所用试剂32-33
• 2.4.7 ATP测定所用试剂33
• 2.5 引物33-34
• 2.5.1 扩线粒体全序引物33
• 2.5.2 PRICKLE3外显子筛查所用引物33-34
• 2.5.3 酶切鉴定PRICK-LE3 157位点PCR扩增引物34
• 2.5.4 鉴定PRICKLE3表达QPCR扩增引物34
• 2.6 实验方法34-44
• 2.6.1 血液DNA的提取方法34-35
• 2.6.2 PCR扩增及酶切鉴定、测序35-36
• 2.6.3 荧光定量PCR36-37
• 2.6.4 PRICKLE3蛋白细胞定位37-38
• 2.6.5 线粒体提取38-39
• 2.6.6 永生化淋巴细胞系的建立39
• 2.6.7 Western Blot检测蛋白表达39-41
• 2.6.8 OCR测定41-42
• 2.6.9 ATP测定42-43
• 2.6.10 ROS测定43
• 2.6.11 线粒体膜电位的测定43-44
• 3 实验结果44-65
• 3.1 WZ162家系分析44
• 3.2 WZ162家系全基因组外显子测序结果44-56
• 3.2.1 原始数据概况44-46
• 3.2.2 目标区域内每个样本的测序深度情况46
• 3.2.3 样本的目标区域内外显子捕获测序的均一性46-47
• 3.2.4 CCDS外显子的测序深度和覆盖度47
• 3.2.5 全基因组外显子测序数据SNP的检测与注释47-48
• 3.2.6 插入/缺失(indels)注释48-49
• 3.2.7 基因突变分析49-56
• 3.3 PRICKLE3蛋白定位56-57
• 3.4 PRICKLE3基因组织表达情况57-58
• 3.5 PRICKLE3蛋白表达检测58-59
• 3.6 呼吸链亚基表达检测59-60
• 3.7 OCR检测、ATP检测60-62
• 3.8 线粒体ROS、膜电位检测62-65
• 4 讨论65-67
• 5 展望67-68
• 参考文献68-75
• 简历75

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