ERK抑制剂对间歇低氧早期大鼠神经元凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响

发布时间：2017-08-15 05:16

  本文关键词：ERK抑制剂对间歇低氧早期大鼠神经元凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响

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【摘要】：目的通过构建大鼠间歇性低氧模型,观察早期间歇低氧后大鼠海马区神经元的凋亡及凋亡相关蛋白的表达,注入ERK抑制剂(U0126)将ERK信号通路阻断,探讨ERK信号通路对早期间歇低氧大鼠海马CA1区神经元凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。方法选取Wistar成年雄性大鼠135只,采用随机数字法随机分为正常对照组(UC组)、间歇低氧组(IH组)、ERK抑制剂组(U0126组),每组又分为1d、3d、7d、10d、14d五个时间亚组,每个亚组选取9只大鼠。ERK抑制剂组于每日晨起7:00尾静脉注入U0126(0.2mg/kg),注射30min后与IH组大鼠一起放入低氧箱内,使低氧箱内交替循环不同流速的压缩空气及氮气,其中每个循环时间为120s,氧浓度波动在5%至21%之间,每日暴露时间为7h;UC组大鼠置于低氧箱内,持续给予21%氧浓度的空气。每天各组大鼠实验结束后,置于饲养条件及生活环境相同的普通饲养箱,给予充足的饲料及水源。在设计好的时间点处死大鼠,采用免疫组织化学法检测各组大鼠海马CA1区ERK1/2、P53、Bax、Bcl-2的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马CA1区ERK1/2、P53的表达;应用原位末端标记法检测大鼠海马CA1区神经细胞的凋亡。免疫组化结果采用Motic医学图像分析系统进行半定量分析,分析所得结果用积分光密度(IOD)值表示;采用Image J软件分析系统分析Western Blot条带的吸光度A值,选择GAPDH作为内参,每个样本取3次重复实验的结果,每个样本的A值与其内参A值相比所得值为最后结果;Tunel实验结果在显微镜40×10相同倍数下观察,每张切片随机选择不同的视野5个,分别算出大鼠海马CA1区神经细胞的总细胞数目及凋亡的细胞数目,凋亡细胞数目/总细胞数目×100%即为细胞凋亡指数(AI)。采用SPSS17.0统计学软件对实验结果进行统计学分析,分析实验所得数据用均数±标准差(xˉ±s)表示,多组间的相互比较采用的方法是单因素方差分析(Oneway ANOVA),其中以P0.05为差异具有统计学意义。结果1大鼠海马CA1区神经细胞细胞凋亡的情况:光镜下凋亡的神经细胞形状呈椭圆形或圆形,细胞胞核的大小各异、形态不规则,着染呈棕褐颜色或棕黄颜色,非凋亡的神经细胞胞核与凋亡细胞相比较大,形态及大小较为均匀,经苏木素复染后呈蓝色。组间比较:与UC组比较,IH组及ERK抑制剂组在第1d神经细胞凋亡指数无明显差异性(P0.05),在第3d、7d、10d、14d的神经细胞凋亡指数显著升高(P0.05);与IH组相比,ERK抑制剂组在第3d、7d、10d、14d的神经细胞凋亡指数明显下降(P0.05);组内比较:UC组内各时间点之间比较神经细胞凋亡指数差异不显著(P0.05);IH组及ERK抑制剂组内各时间点之间比较差异有统计学意义(P0.05),随低氧时间的延长神经细胞凋亡指数呈增加趋势。2大鼠海马CA1区神经细胞ERK1/2蛋白的表达结果:免疫组化及Western Blot结果均显示,组间比较:与UC组比较,IH组海马CAl区神经细胞ERK1/2蛋白表达在1d、3d、7d、10d、14d五个时间点显著升高(P0.05),而ERK抑制剂组ERK1/2蛋白表达在各个时间点无明显差异(P0.05);与IH组相比,ERK抑制剂组ERK1/2蛋白在各个时间点的表达明显降低(P0.05);组内比较:UC组及ERK抑制剂组内各时间点之间比较,ERK1/2蛋白的表达无显著差异(P0.05);IH组内各时间点之间比较,蛋白表达差异有统计学意义(P0.05),呈先升高后下降的趋势,在第10d表达较多。3大鼠海马CA1区神经细胞P53蛋白表达的结果:免疫组化及Western Blot结果均显示,组间比较:与UC组比较,IH组及ERK抑制剂组海马CAl区神经细胞P53蛋白表达在1d、3d、7d、10d、14d五个时间点显著升高(P0.05);与IH组相比,ERK抑制剂组P53蛋白在各个时间点的表达明显降低(P0.05);组内比较:UC组内各时间点之间比较P53蛋白表达差异不显著(P0.05);IH组及ERK抑制剂组内各时间点之间比较差异有统计学意义(P0.05),呈先升高后下降的趋势,在第10d表达较多。4大鼠海马CA1区神经细胞Bax蛋白表达的结果:免疫组化结果显示,组间比较:与UC组比较,IH组及ERK抑制剂组海马CAl区神经细胞Bax蛋白表达在1d、3d、7d、10d、14d五个时间点显著升高(P0.05);与IH组相比,ERK抑制剂组Bax蛋白在各个时间点的表达明显降低(P0.05);组内比较:UC组内各时间点之间比较Bax蛋白表达差异不显著(P0.05);IH组及ERK抑制剂组内各时间点之间比较差异有统计学意义(P0.05),呈先升高后下降的趋势,于第10d蛋白表达较多。5大鼠海马CA1区神经细胞Bcl-2蛋白表达的结果:免疫组化结果显示,组间比较:与UC组比较,IH组及ERK抑制剂组海马CAl区神经细胞Bcl-2蛋白表达在1d、3d、7d、10d、14d五个时间点显著升高(P0.05);与IH组相比,ERK抑制剂组Bcl-2蛋白在各个时间点的表达明显增高(P0.05);组内比较:UC组内各时间点之间比较Bcl-2蛋白表达差异不显著(P0.05);IH组及ERK抑制剂组内各时间点之间比较差异有统计学意义(P0.05),呈先升高后下降的趋势,于第10d蛋白表达较多。结论1间歇低氧早期可以引起海马CA1区神经元的凋亡及凋亡相关蛋白的表达,同时激活ERK信号通路。2 ERK抑制剂U0126通过阻断ERK信号通路降低了促凋亡基因P53的表达,同时使Bcl-2与Bax的比值增加,从而减少间歇低氧早期神经元的凋亡。
【关键词】：间歇低氧 ERK信号通路 神经元凋亡 凋亡蛋白 海马
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R766
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 引言13-15
• 第1章 实验研究15-43
• 1.1 材料与方法15-23
• 1.1.1 实验动物15
• 1.1.2 主要仪器设备与试剂15-17
• 1.1.3 动物分组、处理及大鼠间歇低氧低氧模型制作17-19
• 1.1.4 标本制作方法19-20
• 1.1.5 海马神经细胞ERK1/2、P53、Bax、Bcl-2 蛋白检测及判定20-22
• 1.1.6 海马神经细胞凋亡的检测及判定（DNA末端原位标记法）22-23
• 1.1.7 统计学处理23
• 1.2 结果23-34
• 1.2.1 各组大鼠海马神经细胞凋亡的变化23-25
• 1.2.2 各组大鼠海马神经细胞ERK1/2 蛋白表达的变化25-28
• 1.2.3 各组大鼠海马神经细胞P53蛋白表达的变化28-30
• 1.2.4 各组大鼠海马神经细胞Bax蛋白表达的变化30-32
• 1.2.5 各组大鼠海马神经细胞Bcl-2 蛋白表达的变化32-34
• 1.2.6 各组大鼠海马神经细胞Bcl-2 与Bax蛋白IOD值比值的变化34
• 1.3 讨论34-39
• 1.3.1 间歇低氧与ERK信号通路34-35
• 1.3.2 间歇低氧ERK信号通路的激活与神经细胞凋亡35-37
• 1.3.3 间歇低氧及U0126处理后海马CA1区P53蛋白表达的变化37-38
• 1.3.4 间歇低氧及U0126处理后海马CA1区Bax、Bcl-2 蛋白表达的变化38-39
• 1.4 本章小结39
• 参考文献39-43
• 第2章 综述43-51
• 2.1 细胞凋亡与间歇低氧神经损伤43-44
• 2.2 ERK信号通路的抗凋亡作用44
• 2.3 ERK信号通路的促凋亡作用44-45
• 2.4 小结45-46
• 参考文献46-51
• 结论51-52
• 致谢52-53
• 导师简介53-54
• 作者简介54-55
• 学位论文数据集55

【参考文献】

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本文编号：676415