喉癌相关miRNAs的筛选及其功能的初步研究

发布时间：2017-08-16 00:14

  本文关键词：喉癌相关miRNAs的筛选及其功能的初步研究

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【摘要】：[目的]运用mi RNA基因芯片技术、Real-time PCR技术及mi RNA功能实验,探讨mi RNAs与喉癌发生发展的关系。[方法]1.应用分光光度计及琼脂糖凝胶电泳法鉴定抽提RNA样本的质量;对抽提的RNA样本进行荧光标记及杂交等处理,在4对喉癌组织及癌旁组织样本中筛选喉癌相关差异表达的mi RNAs。2.在4对喉癌组织及癌旁组织中,应用Real-time PCR技术检测mi R-99a-5p,mi R-195-5p,mi R-3195,mi R-101-3p,mi R-126-3p的表达情况验证基因芯片检测结果的可靠性;在28对喉癌组织及癌旁组织的大样本中,再次检测mi R-99a-5p、mi R-195-5p、mi R-3195、mi R-101-3p、mi R-126-3p的表达。检测采用ABI 7500 PCR仪,数据分析用CT分析法,内参用Sn RNA U6,定量:采用??CT(Cycle threshold)法相对定量,计算公式参照:比率=2-??ct=2-[?Ct(样品)-?Ct(标准品)],?Ct=Ct(目标基因) Ct(内参)。3.将合成的mi R-3195模拟物(mimic)及抑制物(inhibitor)分别转染至喉癌Hep2细胞株中,应用MTT实验、克隆形成实验在各个实验组(mi R-3195 mimic组、mimic NC组、mi R-3195 inhibitor组、inhibitor NC组、未转染组)中观察mi R-3195表达上调或下调对喉癌Hep2细胞增殖情况的影响。4.将合成的mi R-3195模拟物(mimic)转染至喉癌Hep2细胞株中。应用流式细胞术在各个组(mi R-3195 mimic组、mimic NC组、未转染组)中检测mi R-3195表达上调对喉癌Hep2细胞凋亡及细胞周期的影响。[结果]1.RNA样本的质量鉴定结果显示:抽提的每个RNA样本的质量均满足条件,可以进行下一步实验。经过相关软件分析,从基因芯片检测结果中,筛选出了42个二倍以上差异表达的喉癌相关mi RNAs。mi R-21-5p、mi R-3651、mi R-222-3p、mi R-1246、mi R-181d,mi R-193b-3p等22个mi RNAs在4例喉癌组织中的表达均上调(Foldchange2,P0.05);mi R-99a-5p、mi R-195-5p、mi R-3195、mi R-101-3p、mi R-126-3p等20个mi RNAs在4例喉癌组织中的表达均下调(Foldchange0.5,P0.05)。2.Real-time PCR的实验结果证实了mi R-99a-5p,mi R-195-5p,mi R-3195,mi R-101-3p,mi R-126-3p等5个mi RNAs在4例喉癌组织中均下调,与基因芯片检测结果一致,说明基因芯片结果是可靠的。在28例大样本喉癌组织标本中mi R-3195显著下调,且差异具有统计学意义(P0.05)。3.MTT实验结果显示:转染mi R-3195 mimic组喉癌Hep2细胞的活细胞数量明显低于对照组(P0.05),mi R-3195表达上调显著抑制细胞增殖能力;反之,转染mi R-3195 inhibitor组喉癌Hep2细胞的活细胞数量明显高于对照组(P0.05),mi R-3195表达下调显著增强细胞的增殖能力。4.细胞克隆形成实验结果显示:转染mi R-3195 mimic组喉癌Hep2细胞的克隆形成数明显低于对照组(P0.05),mi R-3195表达上调显著抑制细胞增殖能力;转染mi R-3195 inhibitor组喉癌Hep2细胞的形成克隆数明显高于对照组(P0.05),mi R-3195表达下调显著增强细胞的增殖能力。5.流式检测结果显示:转染mi R-3195 mimic组喉癌Hep2细胞的凋亡率明显高于对照组(P0.05),mi R-3195表达上调细胞凋亡率显著增加。转染mi R-3195 mimic组喉癌Hep2细胞的细胞周期中,G1期的细胞明显增多(P0.05),mi R-3195表达上调使得喉癌Hep2细胞阻滞于G1期,向S期转变减少,从而抑制Hep2细胞的增殖。[结论]1.首次发现mi R-3195在喉癌组织中显著下调。2.mi R-3195可作为抑癌基因抑制喉癌细胞的增殖能力及细胞周期进展、促进喉癌细胞的凋亡参与喉癌的调控。
【关键词】：喉癌 mi RNAs mi R-3195
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.65
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 第1章 绪论13-17
• 第2章 喉癌相关mi RNAs的筛选17-37
• 2.1 材料17-19
• 2.2 方法19-23
• 2.3 结果23-30
• 2.4 讨论30-37
• 第3章 miR-3195 抑制喉癌Hep2细胞株增殖的实验研究37-51
• 3.1 材料37-38
• 3.2 方法38-42
• 3.3 结果42-47
• 3.4 讨论47-51
• 第4章 结论51-53
• 参考文献53-59
• 文献综述59-71
• 参考文献65-71
• 攻读硕士学位期间科研成果71-73
• 资助科研的基金项目73-75
• 致谢75

【共引文献】

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本文编号：680567