Vimentin野生型和E151K突变体稳定表达晶状体细胞株的建立

发布时间：2017-08-19 06:04

  本文关键词：Vimentin野生型和E151K突变体稳定表达晶状体细胞株的建立

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【摘要】：波形蛋白Vimentin是一种在内皮或者其他间质细胞中表达的III型中间纤维蛋白,眼睛晶状体上皮细胞中就有大量表达的波形蛋白。波形蛋白有三个结构域,由一个含α螺旋的中心杆域连接N端的头部域和C端的尾部域。作为一种主要的骨架蛋白,波形蛋白参与细胞核与膜的连接和信号转导,影响晶状体细胞的分化,与细胞的迁移和运动有关,在伪足中就有波形蛋白。波形蛋白还受磷酸化作用的调节,蛋白激酶C可调控它的一些磷酸化位点。此外,波形蛋白在癌细胞中高表达使癌细胞获得侵袭性。晶状体正常状态的维持与波形蛋白息息相关,波形蛋白基因突变会导致波形蛋白组装紊乱从而引发疾病。波形蛋白编码基因外显子1第596号碱基的突变(G596A)造成第151号位的谷氨酸突变成赖氨酸(E151K),导致Vimentin骨架蛋白组装紊乱。由于跟SUMO特异性结合的底物一般都具有一个相同的基序ΨKx E/D,其中Ψ为疏水性氨基酸,K为目标赖氨酸,x是任何氨基酸,所以E151K的突变将导致一个十分保守的SUMO化位点的产生。我们推测E151K突变可能导致Vimentin单体被SUMO化,造成晶状体中波形蛋白纤维组装困难,从而产生白内障。为了证明此推测,我们构建了Vimentin野生型和E151K cDNA突变体的质粒,并把野生型和突变体质粒分别转入了小鼠的晶状体上皮细胞α-TN4-1中,用含有600ug/ml的G418培养基筛选,建立了稳定表达的细胞株,并用免疫荧光染色技术观察到了转染细胞与正常细胞的形态差异。为进一步确定E151K是否能被SUMO化而导致Vimentin组装病变打下了必要的基础。通过实验我们发现:正常的α-TN4-1细胞的波形蛋白骨架十分清晰,在远核端汇聚形成的放射线笔直而修长;转染了VIM的细胞虽也观察到由波形蛋白形成的细长的延伸部分,但明显在延伸的多处都发生了弯曲;而转染了E151K的细胞则观察不到延伸部分或延伸部分明显缩减,波形蛋白围绕在核周围呈不规则弥散状。
【关键词】：Vimentin E151K SUMO SUMO化 白内障 α-TN4-1
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R776;Q51
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 前言12-24
• 1 中间纤维家族12-14
• 1.1 中间纤维的结构12-13
• 1.2 中间纤维和细胞骨架13
• 1.3 中间纤维和眼睛晶状体13-14
• 2 波形蛋白（Vimentin）14-19
• 2.1 波形蛋白的结构15
• 2.2 波形蛋白组装和去组装15
• 2.3 波形蛋白和细胞接触15-16
• 2.4 波形蛋白和信号转导16
• 2.5 波形蛋白和细胞运动16-17
• 2.6 波形蛋白和癌细胞17-18
• 2.7 胚胎发生中波形蛋白的表达18
• 2.8 波形蛋白突变E151K和白内障18-19
• 3 小泛素相关修饰物（SUMO）19-23
• 3.1 SUMO家族20-21
• 3.2 SUMO与泛素化21
• 3.3 SUMO化修饰的酶学21-22
• 3.4 SUMO化的功能22-23
• 4 本课题研究背景23-24
• 第二章 材料、试剂以及研究方法24-42
• 1 本实验的材料24
• 2 本实验的试剂24
• 3 实验仪器24-25
• 4 实验方法25-42
• 4.1 获得小鼠晶状体c DNA25-26
• 4.2 克隆小鼠晶状体Vimentin26-32
• 4.3 克隆小鼠VIM突变体E151K32-35
• 4.4 保存VIM和E151K的质粒及菌液35-36
• 4.5 建立Vimentin和E151K稳定的晶状体细胞株36-38
• 4.6 PCR检测Vimentin和E151K稳定转染的晶状体细胞株38-40
• 4.7 细胞免疫荧光染色40-42
• 第三章 实验结果与讨论42-59
• 1 实验结果42-57
• 1.1 小鼠VIM PCR结果及序列比对42-44
• 1.2 小鼠突变体E151K PCR结果及序列比对44-46
• 1.3 检测PCR结果46
• 1.4 免疫荧光染色结果图46-57
• 2 实验讨论57-59
• 参考文献59-68
• 附录68-69
• 致谢69

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1 吕海侠,刘勇,李敏杰,肖新莉,丁海燕,凌凤东;人脑不同发育期vimentin阳性细胞的分布[J];第四军医大学学报;2002年14期

2 赵士福;黄其林;李黔宁;Jean Gascuel;;中间丝蛋白vimentin在非洲爪蛙嗅球发育过程中的表达及意义[J];神经解剖学杂志;2007年01期

3 赵新燕,冯丽冰,周伟国,戴卫列,李昌本,赵寿元;Screening of proteins that interact with human thrombopoietin receptor c-Mpl using yeast two-hybrid system[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2000年03期

4 ;Shock Waves Increase T-cell Proliferation or IL-2 Expression by Activating p38 MAP Kinase[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2004年11期

5 刘光,丁华野,皋岚湘,邓永江;乳腺癌中Vimentin与P-糖蛋白表达和其它预后指标的相关性研究[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2001年02期

6 马文丽,薛社普;波形蛋白、核纤层蛋白与排核关系的研究[J];实验生物学报;1994年03期

7 ;[J];;年期

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1 ;Epithelial-mesenchymal transition of oral epithelial cells immortalized by HPV16 E6 and E7[A];2004年上海市口腔医学学术年会论文汇编[C];2004年

2 ;Alterations in the intracellular Ca~(2+) concentration and vimentin in endothelial cells following tumor cell-endothelial cell interactions[A];中国药理学会第十一届全国化疗药理学术研讨会论文集[C];2012年

3 卢一平;杨立;;The Explorative Study of Expression and Drug Intervention of Vimentin, Anti-Vimentin antibodies, C4d in Chronic Allograft Nephropathy[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年

4 王，

本文编号：699049